¿En Qué Consiste la Biotecnología?

Utilización de las propiedades y componentes de seres vivos para fines prácticos e industriales. Se puede definir como cualquier aplicación (basada en procesos científicos y técnicos) que utiliza en alguna de sus etapas organismos vivos o sus derivados para crear o modificar productos o procesos útiles para los humanos.

Aplicaciones de la Biotecnología

Utilización de organismos vivos o sus componentes (células y biomoléculas como enzimas, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) para crear o modificar productos o procesos útiles para el ser humano. La biotecnología tiene aplicaciones en diferentes áreas:

• Biomedicina
• Agrícola
• Ambiental
• Industrial
• Marina

Técnicas Clave en Biotecnología Molecular

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

¿Qué es la PCR?

Técnica que permite amplificar un fragmento de ADN, generando múltiples copias del mismo. Se trata de un procedimiento de clonación acelular de moléculas de ADN.

Materiales para PCR

Es necesario el ADN que se desea replicar, ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, la Taq polimerasa), nucleótidos trifosfato de adenina, guanina, citosina y timina, y un ADN cebador (primer).

Proceso de la PCR (Referencia a Diagrama)

a. Proceso: PCR.

b. Descripción de las etapas:

1. En 1 se observa la desnaturalización del ADN al aumentar la temperatura a más de 90ºC.
2. En 2 se representa la hibridación del ADN que se quiere clonar con un primer y esto ocurre al disminuir la temperatura a 50 y pico ºC.
3. En 3 se aumenta la temperatura hasta 70 y pico ºC, temperatura a la cual actuará una polimerasa termoestable que añade nucleótidos, produciendo la replicación de la cadena de ADN a partir de los primers.

Aplicaciones de la PCR

Esta técnica es útil para obtener múltiples copias de un fragmento de ADN para diferentes fines, tales como:

• Secuenciación del ADN
• Estudios evolutivos
• Huellas dactilares genéticas

Aplicaciones Adicionales de la PCR

c. Obtener suficiente cantidad de ADN de un organismo extinto para realizar estudios evolutivos, o para posteriormente secuenciar un ADN o para realizar investigaciones policiales, etc.

Secuenciación de ADN

Secuenciación de ADN: Sanger vs NGS

La secuenciación de Sanger permite secuenciar un gen concreto, mientras que las NGS (Secuenciación de Nueva Generación) permiten secuenciar una gran cantidad de fragmentos de ADN de modo paralelo y en muy poco tiempo.

Secuenciación de Sanger

Molécula Clave en la Secuenciación de Sanger

a. Un didesoxinucleótido (ddNTP) con el OH en 3´ sustituido por un H.

Fundamento de la Técnica de Sanger

b. Se emplea en la técnica de secuenciación de Sanger, que se fundamenta en el uso controlado de ddNTP de A, G, C y T que detienen la síntesis de la cadena en formación puesto que, para la síntesis de ADN, la ADN polimerasa utiliza dNTP. Se desnaturaliza el ADN y se añade ADN polimerasa, primers y dNTP para la replicación. En diferentes procesos de replicación se añaden ddNTP de A, G, T y C respectivamente, con lo que se obtendrán fragmentos de ADN de diferentes tamaños según el lugar donde se haya detenido la síntesis, que nos indica la posición del nucleótido correspondiente. Posteriormente, mediante electroforesis se separan los fragmentos.

Interpretación de Resultados de Electroforesis en Gel (Secuenciación de Sanger)

a. Representa la electroforesis en gel realizada como paso final de la técnica de secuenciación de Sanger, mediante la cual se puede averiguar el tamaño de los fragmentos logrados con la replicación con cada uno de los cuatro tipos de ddNTP (los fragmentos migran en función del tamaño: los más pequeños están más lejos).

b. Ejemplo de secuencia obtenida: CGATGAAGCT.

Tecnología del ADN Recombinante

Finalidad de la Tecnología del ADN Recombinante

La clonación celular de fragmentos de ADN, es decir, introducir un gen de interés en células hospedadoras, generalmente bacterias, para que se replique dentro de ellas.

¿Qué es el ADN Recombinante?

Molécula de ADN formada por la unión de 2 fragmentos de distinto origen: el gen que interesa clonar (inserto) y una molécula de ADN que actúa como transportadora (vector) para introducir el gen en las células hospedadoras.

Función de las Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas, es decir, son capaces de romper los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos. Estas rompen la cadena de nucleótidos en una región concreta, que tiene una secuencia determinada de nucleótidos. Son producidas por distintas bacterias, en las que actúan como mecanismos de defensa contra los virus bacteriófagos.

Especificidad de las Enzimas de Restricción

Reconocen en el ADN una determinada secuencia de bases nitrogenadas, denominada sitio de restricción, y cortan las dos cadenas de ADN dentro de esta secuencia concreta.

¿Qué es un Sitio de Restricción?

Lugar concreto que reconoce una enzima de restricción; se trata de secuencias de ADN concretas, de cuatro a ocho bases, y suelen ser secuencias palindrómicas.

Sitios de Restricción y Secuencias Palindrómicas

Significa que la secuencia de nucleótidos es la misma en ambas cadenas cuando se leen en dirección 5’→3’.

Necesidad de una Célula Hospedadora en ADN Recombinante

Esta es necesaria para que el ADN recombinante se replique, formándose múltiples copias del mismo y, dependiendo del caso, el gen de interés se exprese y pueda sintetizarse la proteína correspondiente.

Etapas del Procedimiento de Clonación Celular (Tecnología del ADN Recombinante)

1. Preparación del vector y del gen de interés (se cortan con enzimas de restricción).
2. Formación del ADN recombinante.
3. Introducción del ADN recombinante en la célula hospedadora.
4. Replicación del ADN recombinante.
5. Proliferación celular (de las células hospedadoras).
6. Selección de las células hospedadoras que han incorporado el ADN recombinante.
7. Expresión del gen (si la finalidad es la clonación de una proteína).

Componentes y Proceso Básico de ADN Recombinante (Ejemplo)

Vector: en este caso el plásmido.

Gen de interés o inserto.

Enzimas de restricción con las que se cortan el vector y el inserto, las cuales dejan extremos cohesivos complementarios en el plásmido y el gen de interés.

Unión del vector y el inserto para lograr el plásmido recombinante.

Ligasa que permita sellar la unión de vector e inserto.

(Nota: La mención al Síndrome de Hutchinson-Gilford en el texto original no tiene una conexión clara con la explicación proporcionada aquí).

Proceso de Creación de ADN Recombinante (Referencia a Diagrama)

a. El corte de dos moléculas de ADN con las mismas enzimas de restricción (por tanto, cortan en una misma secuencia), de tal forma que se generan extremos cohesivos.

b. Porque las regiones monocatenarias del ADN resultantes del corte de ambas moléculas con la misma enzima de restricción son complementarias y se unen, obteniéndose un ADN recombinante.

Edición Genética con CRISPR-Cas9

¿Qué es CRISPR?

Técnica de edición genética que permite cortar el ADN en un sitio específico y editarlo (permite modificar los genes), es decir, permite reescribir la secuencia de nucleótidos de cualquier gen. También se conoce como mutagénesis dirigida.

Mecanismo Básico de Edición Genética (CRISPR)

El uso de proteínas Cas que sintetizan las bacterias para cortar el ADN vírico y el de un ARN guía que permita localizar y unirse a un ADN el cual se quiere modificar. Esta técnica permite la edición genética, es decir, cortar una secuencia diana de ADN determinada e insertar una nueva secuencia que reemplace a la original, con lo que es posible no solo silenciar un gen, sino también corregir el fallo.

Pasos en la Edición Genética con CRISPR-Cas9

1. Se parte de una secuencia diana conocida que se quiere modificar.
2. El ARN guía se une a la secuencia diana, ya que en uno de sus extremos tiene unido un ARN complementario a la secuencia diana.
3. La enzima Cas9 se une al ARN guía.
4. La enzima Cas9 corta ambas cadenas de ADN.
5. Con esta técnica no solo se ha logrado cortar un gen silenciándolo, sino que también ha sido posible insertar nuevas secuencias de ADN en el sitio de corte, reemplazando la secuencia original por una nueva (inserción de un gen de interés).

Elementos Clave en la Edición Genética (Referencia a Imagen)

• a. 1. Molécula de ADN 2. ARN guía 3. Secuencia diana; 4. Secuencia NGG.
• b. Se trata de la secuencia diana de ADN, la cual se quiere modificar y a la que se une el ARN guía (el cual está unido a la proteína Cas9).
• c. Mutagénesis dirigida.
• d. Como la enzima es Cas9, se trata de Streptococcus pyogenes.
• e. Secuencia diana de ADN, la cual se quiere modificar.
• f. Unirse por puentes de hidrógeno a la secuencia diana del ADN, de tal forma que dirige a la enzima Cas9 a la región específica que se desea cortar (secuencia diana).

Tecnología de Edición Genética: CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 de edición génica o mutagénesis dirigida.

Componentes Clave de CRISPR-Cas9 (Referencia a Diagrama)

• 1: Cas9
• 2: ARN guía
• 3: Secuencia diana del ADN que se pretende editar
• 4: Secuencia del ARN guía complementaria de la secuencia diana
• 5: ADN original
• 6: Nueva secuencia insertada en el ADN
• 7: ADN modificado mediante edición génica

Función de los Componentes (CRISPR-Cas9)

1, que es la enzima Cas9, corta las dos hebras de ADN en la secuencia diana; y 2, que es el ARN guía, lleva a la enzima Cas9 hasta la secuencia diana del ADN.

Origen Natural del Sistema CRISPR-Cas

El sistema CRISPR-Cas forma parte de un sistema defensivo natural de las bacterias contra las infecciones víricas. Cuando un virus infecta a una bacteria, le inyecta su ADN; la bacteria responde produciendo enzimas Cas para cortar en trozos el ADN vírico, lo fragmenta e incorpora los fragmentos en su genoma, pero no lo hace al azar, sino entre las secuencias CRISPR. Posteriormente, los fragmentos de ADN viral se transcriben y se obtienen ARNs que las proteínas Cas usan como guías para identificar y degradar ácidos nucleicos virales en infecciones posteriores.

Mecanismo de Acción de CRISPR-Cas9

1. El ARN guía se une a una secuencia de ADN diana y la enzima Cas9 se une al ARN guía.
2. La enzima Cas9 corta ambas cadenas de ADN.
3. III y IV representan dos alternativas, según la finalidad del proceso:

• III: Se puede provocar una deleción y silenciar determinados genes.
• IV: Otra opción es introducir un nuevo fragmento de ADN reemplazando la secuencia original de ADN.

Áreas de Aplicación (Referencia a Diagrama)

• A: Industria alimentaria
• B: Investigación biomédica
• C: Edición de embriones humanos
• D: Medicina

Hibridación de Ácidos Nucleicos

• a. Molécula de ADN dúplex en el que las dos cadenas tienen diferente origen.
• b. La hibridación ocurre cuando dos cadenas tienen secuencias complementarias y se ponen en contacto.
• c. Puede darse entre una cadena de ADN y una de ARN siempre que posean secuencias complementarias.
• d. Se utiliza para identificar en una muestra de ADN una secuencia de nucleótidos denominada secuencia diana. Por ejemplo, el ADN de un patógeno, una secuencia en la que haya una mutación causante de una enfermedad.

Electroforesis en Gel de Agarosa

Técnica de separación de moléculas en función de su movilidad, sometidas a un campo eléctrico. El ADN presenta cargas negativas en los grupos fosfato que están ionizados; por tanto, fragmentos de ADN sometidos a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo. La agarosa es un polisacárido que, en disolución, forma un gel semisólido que ofrece resistencia al avance de las moléculas; los fragmentos de ADN de menor tamaño se desplazan con más rapidez, por lo que la electroforesis separa los fragmentos de ácido nucleico según su longitud.

Vectores de Clonación

Características Esenciales de los Vectores de Clonación

1. Poseer un origen de replicación, es decir, que posea la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.
2. Poseer un sitio de restricción, donde las enzimas de restricción puedan cortar.
3. Poseer un marcador que permita seleccionar fácilmente a las células hospedadoras que lo han incorporado, por ejemplo, un gen que le confiera resistencia a antibióticos.

Glosario de Términos Clave

Biblioteca génica: Es una genoteca que posee los fragmentos de ADN que se expresan en un organismo, es decir, aquellos que codifican proteínas.

Biblioteca genómica: Contienen el conjunto total de ADN de un organismo, contiene tanto las secuencias que se expresan como las que no se expresan.

Organismo transgénico: Aquel que posee un gen de otra especie.

Organismo cisgénico: Organismo al que se le ha introducido algún gen de otro organismo de su misma especie, mediante una técnica de biotecnología como puede ser CRISPR-Cas9.

Vector de clonación: Es una molécula de ADN que se une al gen que se desea clonar (inserto) y que va a permitir la entrada de este ADN recombinante a la célula hospedadora facilitando, a su vez, la replicación del mismo.

Definición de Secuencia Palindrómica

Una secuencia palindrómica del ADN es aquella que posee la misma secuencia de nucleótidos si se lee de izquierda a derecha o de derecha a izquierda, es decir, la secuencia es la misma en ambas cadenas del ADN al leerlas en sentido 5´a 3´.

Organismos Genéticamente Modificados (OGM)

Se trataría de un OGM de tipo cisgénico, al que se le ha introducido algún gen de su misma especie. Si procede de un organismo diferente, se trataría de un OGM de tipo transgénico.