Clonación Molecular: Principios y Componentes Esenciales

La clonación molecular es un proceso fundamental en biología molecular que implica la amplificación de secuencias de ADN genómico o de ADNc. Consiste en la introducción de un fragmento de ADN, denominado inserto, dentro de una molécula de ADN llamada vector, la cual tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma, independientemente del genoma de la célula hospedadora.

Ventajas de la Clonación Molecular

• Obtención de cantidades ilimitadas de la secuencia de ADN de interés.
• Posibilidad de clonar secuencias de ADN de gran tamaño.
• Permite clonar el genoma completo de un organismo en un único proceso.
• Facilita la expresión de genes de interés en células hospedadoras.

Componentes Imprescindibles para Clonar ADN

• Vectores de clonación: Moléculas de ADN que transportan el inserto.
• Células hospedadoras: Organismos donde el vector se replica y amplifica.
• Enzimas de restricción: Herramientas moleculares para cortar el ADN en sitios específicos.
• ADN ligasa: Enzima que une el inserto al vector.

Partes de un Vector de Clonación

• Origen de replicación (ori): Secuencia de ADN donde se reconocen las proteínas que inician la replicación del vector, asegurando su amplificación independiente.
• Polylinker (o sitio de clonación múltiple): Región que contiene múltiples sitios de restricción únicos, lo que permite la inserción de diversos fragmentos de ADN.
• Marcadores de selección: Genes que permiten identificar las células que han incorporado el vector, a menudo confiriendo resistencia a antibióticos (ej., ampicilina o kanamicina) o produciendo una proteína detectable.

Tipos de Vectores de Clonación

• Plásmidos: Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano que se replican de forma independiente del cromosoma bacteriano. Son ideales para insertos pequeños.
• Bacteriófagos: Virus que infectan bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados. Se utilizan para insertos de tamaño mediano.
• Fagémidos: Vectores híbridos que combinan características de plásmidos y bacteriófagos, conteniendo un origen de replicación del fago M13, lo que permite la producción de ADN monocatenario.
• Cósmidos: Vectores híbridos que combinan elementos del cromosoma del fago λ y un plásmido, incluyendo un polylinker. Permiten clonar insertos de mayor tamaño que los plásmidos.
• Cromosomas Artificiales de Levadura (YACs): Vectores de clonación capaces de transportar insertos de ADN de gran tamaño, de cientos de kilobases a megabases (hasta 1 Mb o más).

Células Hospedadoras en Clonación Molecular

Las células hospedadoras son organismos en los que se introduce y amplifica el vector de clonación mediante replicación. Son esenciales para la propagación y expresión del ADN recombinante.

Tipos de Células Hospedadoras

• Procariotas: Principalmente bacterias (ej., Escherichia coli).
• Eucariotas:
  • Levaduras (ej., Saccharomyces cerevisiae para plásmidos de levadura o YACs).
  • Células animales (ej., para vectores basados en baculovirus).
  • Células vegetales (ej., para el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens).

Secuenciación de ADN: Métodos y Evolución Tecnológica

La secuenciación de ADN es el proceso para determinar el orden exacto de los nucleótidos (adenina, timina, citosina, guanina) en una molécula de ADN o ARN. Es una herramienta fundamental en genómica y biotecnología.

Métodos de Secuenciación Clásicos (Primera Generación)

Método de Maxam y Gilbert

Este método se basa en la modificación química del ADN y la posterior escisión selectiva de bases (purinas y pirimidinas).

Etapas:

1. Marcaje del ADN en un extremo.
2. Modificación química de las bases.
3. Escisión selectiva de las bases modificadas.
4. Electroforesis en gel para separar los fragmentos por tamaño.
5. Lectura de la secuencia a partir del patrón de bandas.

Sustancia clave: La piperidina es una sustancia que rompe las cadenas de ADN en los sitios modificados.

Método de Sanger (Secuenciación por Terminación de Cadena)

También conocido como método dideoxi, se basa en la terminación de la elongación de la cadena de ADN debido al uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs), que carecen del grupo 3′-hidroxilo necesario para la formación del enlace fosfodiéster.

Etapas:

1. Reacción de polimerización: Cada reacción contiene ADN molde, un cebador, nucleótidos desoxinucleótidos (dNTPs) y una pequeña cantidad de un ddNTP específico (ddATP, ddTTP, ddCTP o ddGTP). La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas.
2. Separación de los fragmentos: Los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida o, en versiones automatizadas, por electroforesis capilar.
3. Detección y lectura de la secuencia: En el Sanger automatizado, los ddNTPs están marcados con fluorocromos diferentes, permitiendo la detección simultánea de las cuatro bases en una única reacción.

Sustancia clave: Los ddNTPs impiden la elongación de la cadena.

Técnica clásica más automatizada: El método de Sanger.

Tecnologías de Secuenciación de Nueva Generación (NGS)

Las tecnologías de NGS permiten secuenciar millones de fragmentos de ADN en paralelo, revolucionando la genómica.

Segunda Generación

• Secuenciación por Síntesis (ej., Illumina): Se basa en la detección de fluorescencia emitida por nucleótidos marcados que se incorporan a la cadena de ADN en crecimiento.
• Tecnología Ion Torrent: Obtiene la secuencia del ADN por la detección de microvariaciones del pH que se producen cuando se libera un protón durante la incorporación de cada nucleótido.

Tecnología Ion Torrent detecta: Variaciones de pH.

Tercera Generación

Estas tecnologías se basan en la lectura de nucleótidos individuales sin necesidad de amplificación previa.

• Secuenciación por Nanoporos (ej., Oxford Nanopore Technologies): Mide los cambios eléctricos que produce cada nucleótido al pasar a través de un poro proteico (nanoporo).

Técnicas de Introducción de ADN en Células

La introducción de ADN exógeno en células es un paso crucial en la ingeniería genética.

Transformación Bacteriana

Proceso por el cual una bacteria capta e internaliza moléculas de ADN exógeno (desnudo) presentes en el medio externo. No todas las bacterias son capaces de realizar este proceso de forma natural; solo aquellas denominadas «competentes». La competencia puede ser natural o inducida artificialmente mediante diversas técnicas (ej., choque térmico con CaCl₂).

Transfección

Introducción de ADN exógeno en células eucariotas (principalmente animales), análogo a la transformación bacteriana.

Tipos de Transfección:

• Transfección estable: El ADN se integra en el genoma de la célula hospedadora y se transmite a las células hijas durante las divisiones celulares.
• Transfección transitoria: El ADN introducido no se integra en el genoma y se mantiene de forma episomal, perdiéndose con las divisiones celulares.

Técnica que introduce ADN en eucariotas animales: Transfección.

Transducción

Transferencia de material genético (ADN) de una célula a otra mediante un virus (comúnmente un bacteriófago en bacterias o virus modificados en eucariotas).

Electroporación

Técnica que utiliza pulsos eléctricos de alto voltaje para aumentar temporalmente la permeabilidad de la membrana celular. Esto permite la entrada de moléculas de ADN (vectores) al interior de la célula, siendo aplicable tanto a procariotas como a eucariotas.

Conceptos Clave y Aplicaciones en Biología Molecular

Definiciones Rápidas

• Clonación molecular: Introducción de ADN en una célula viva para su amplificación y/o expresión.
• Vector que permite inserciones mayores a 1Mb: YAC (Cromosoma Artificial de Levadura).
• Proteína fluorescente utilizada para identificar clones: GFP (Green Fluorescent Protein).
• Biblioteca basada en ARNm: Biblioteca de ADNc (ADN complementario).
• Organismos utilizados para vectores Ti: Agrobacterium tumefaciens.
• Ratón con gen inactivado: Ratón Knockout.

Extremos Cohesivos y Función de la ADN Ligasa

Los extremos cohesivos (o pegajosos) son secuencias de ADN monocatenarias complementarias que se generan tras el corte asimétrico de una enzima de restricción. Estos extremos facilitan la unión de fragmentos de ADN con secuencias complementarias.

La ADN ligasa es una enzima que cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre los extremos de fragmentos de ADN, uniendo el fragmento de ADN a clonar con el vector de clonación.

Extremos que se obtienen cuando se trata un plásmido con enzimas de restricción: Dependiendo de la enzima, se pueden generar extremos romos (sin salientes monocatenarios) o extremos cohesivos.

Tipos de Bibliotecas de ADN

• Biblioteca Genómica: Colección de vectores recombinantes que contienen fragmentos representativos del genoma completo de un organismo.
• Biblioteca Cromosómica: Subconjunto de una biblioteca genómica que contiene fragmentos de un cromosoma específico aislado.
• Biblioteca de ADNc (ADN complementario): Colección de vectores que contienen ADN complementario (ADNc) sintetizado a partir de ARNm. Representa los genes que se están expresando activamente en un tejido o célula en un momento dado.

Ingeniería Genética: Knockout vs. Knockin

• Knockout: Inactivación o eliminación de un gen específico en un organismo (por deleción o interrupción) para estudiar la pérdida de su función.
• Knockin: Sustitución de un gen endógeno por una versión modificada (mutada o con una nueva secuencia) para estudiar la función de la variante o introducir nuevas características.

Ejercicios Prácticos y Resolución de Problemas

Selección e Identificación de Clones Recombinantes

Una suspensión de E. coli sensible a ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol y lactosa negativa se transforma con un vector recombinante. Explica cómo se realizaría la selección e identificación de los clones recombinantes en los siguientes supuestos:

1. Vector con resistencia a tetraciclina y gen de resistencia a ampicilina interrumpido por el inserto:

   Se siembra en un medio de cultivo con tetraciclina. Las bacterias que crecen son aquellas que han incorporado el vector (ya que el gen de resistencia a tetraciclina está intacto). Para identificar los recombinantes, se replica la placa en un medio con ampicilina. Las colonias que no crecen en ampicilina (pero sí en tetraciclina) son las recombinantes, ya que el gen de resistencia a ampicilina ha sido interrumpido por la inserción del fragmento de ADN en el polylinker.

2. Vector con gen letal interrumpido por el inserto:

   Se siembra en una placa con cloranfenicol (o cualquier medio que permita la expresión del gen letal). Las células que crecen son las que tienen el vector recombinante, ya que el gen letal (cuya expresión impediría el crecimiento) ha sido interrumpido por la inserción del fragmento de ADN en el polylinker, permitiendo la supervivencia.

3. Vector con gen de proteína fluorescente (ej., GFP) interrumpido por el inserto:

   Se siembra en una placa con ampicilina. Las colonias que crecen han incorporado el vector. Para identificar los recombinantes, se observan las colonias bajo luz UV: las no fluorescentes son las recombinantes, ya que el gen de la proteína fluorescente (ej., GFP) ha sido interrumpido por la inserción del fragmento de ADN en el polylinker.

Análisis de Secuencias de ADN

Secuencia de ADN a partir de Autorradiografía (Método Sanger)

A partir de la siguiente autorradiografía obtenida por el método dideoxi (Sanger), la secuencia del fragmento de ADN es:

Cadena sintetizada (5′ a 3′): 5′-AAGTGAGGTTATAGATCTGCAACTATGAT-3′

Cadena molde (3′ a 5′): 3′-TTCACTCCAATATCTAGACGTTGATACTA-5′

Identificación de Palíndromes y Enzimas de Restricción

¿Cuál es el palíndrome de 6 nucleótidos presente en la secuencia 5′-TTCAATGGGATCCATGTTGGCCAATGA-3′?

Secuencia complementaria: 3′-AAGTTACCCTAGGTACAACCGGTTACT-5′

Palíndrome identificado:

5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'

El palíndrome identificado es el sitio de reconocimiento de una enzima de restricción. Nómbrala, explica su nomenclatura y su función.

• Enzima: BamHI
• Nomenclatura:
  • B: Procede del género bacteriano (Bacillus).
  • am: Procede de la especie (amyloliquefaciens).
  • H: Indica la cepa (cepa H).
  • I: Es la primera enzima de restricción aislada de esa cepa.
• Función: Reconocer secuencias específicas de ADN y realizar cortes en ellas. BamHI produce extremos cohesivos (o pegajosos).

¿Qué tipos de extremos generaría la acción de esta enzima (BamHI) en la secuencia de nucleótidos descrita anteriormente? Escriba las secuencias originadas.

El sitio de corte de BamHI es G|GATCC. Al cortar la secuencia 5′-TTCAATGGGATCCATGTTGGCCAATGA-3′, se generarían los siguientes extremos cohesivos:

5'-G
3'-CCTAG

y

5'-GATCC-3'
3'-G-5'

Relacione las enzimas de restricción con la metilación del ADN en bacterias.

Las bacterias poseen sistemas de restricción-modificación. Las enzimas de restricción cortan el ADN foráneo (no metilado), mientras que las metilasas bacterianas modifican (metilan) las secuencias de reconocimiento en el ADN propio de la bacteria, protegiéndolo de ser cortado por sus propias enzimas de restricción. Este sistema actúa como un mecanismo de defensa contra la invasión de ADN viral.

Protocolo de Clonación de un Gen Específico

En la especie vegetal A se dispone del gen para la fosfatasa ácida, el cual ha sido clonado. A continuación, se describen los pasos generales de este proceso:

1. Aislamiento del Gen de Interés

   Se extrae el ADN genómico de la especie vegetal A. Posteriormente, el fragmento que contiene el gen de la fosfatasa ácida se amplifica (ej., por PCR) y se le añaden sitios de restricción en sus extremos para ser cortado con enzimas de restricción que generen extremos compatibles con el vector de clonación.

2. Creación del Vector Recombinante

   El vector de clonación (ej., plásmido pBR322) se corta con la misma enzima de restricción utilizada para el gen, generando extremos cohesivos complementarios. El fragmento de ADN del gen de la fosfatasa ácida y el vector se unen mediante la acción de la ADN ligasa, formando el ADN recombinante.

3. Introducción del Vector en la Célula Hospedadora

   Se aumenta la permeabilidad de la pared y membrana celular de la célula hospedadora (ej., mediante choque térmico o electroporación) para facilitar la incorporación del vector recombinante al interior de la bacteria (ej., E. coli) o de la célula vegetal (en el caso de Agrobacterium).