Fundamentos de Cultivos Celulares y Microbianos

1. Comparativa de Medios de Cultivo

Medios de Cultivo:

• Bacteriano: Puede ser sólido. Se diseñan medios selectivos, diferenciales y enriquecidos. Contienen una fuente de carbono, nitrógeno, fósforo y sales minerales.
• Célula Vegetal: Generalmente líquido o semisólido. Contiene glucosa, sales minerales, vitaminas, reguladores de crecimiento, hormonas y una fuente de energía para la oxidación.
• Célula Animal: Líquido, con suero fetal bovino. Contiene aminoácidos esenciales, glucosa, sales minerales y reguladores de pH para tamponamiento.
• Microalgas: Líquido, pueden ser autótrofos o heterótrofos. Contienen una fuente de carbono, nitrógeno, fósforo, oligoelementos y vitaminas. Utilizan la fotosíntesis.

2. Diferencias entre Bacterias y Mohos

Bacterias y Mohos:

• Mohos: Son organismos eucariotas quimioheterótrofos inmóviles con capacidad de reproducción sexual y/o asexual mediante esporas. Son aerobios y presentan una estructura celular filamentosa multinucleada característica.
• Bacterias: Son procariotas, unicelulares, más pequeñas que los mohos, asexuales, tanto aerobios como anaerobios, y su crecimiento es más rápido que el de los mohos.

3. Operación de Cultivos: Batch, Fed-Batch y Continuo

Cultivo Batch

• Se agrega el medio de cultivo o medio de reacción y el microorganismo o la enzima.
• Se aplican condiciones de crecimiento o de reacción controladas.
• El proceso se detiene cuando se agotan los nutrientes del medio de cultivo o cuando se agota el sustrato a transformar.
• No se efectúa adición ni reposición de medio durante el proceso.
• Comienza a ser rentable tras la fase de latencia.

Cultivo Fed-Batch

• Se agrega el medio de cultivo o medio de reacción y el microorganismo o la enzima. Se controlan las condiciones de reacción y se monitoriza el crecimiento.
• Al alcanzar una determinada concentración de biomasa:
• Se agrega medio de cultivo fresco diluyendo la mezcla.
• Se retira un volumen de biomasa que se repone por un volumen de medio de cultivo equivalente.

Cultivo Continuo

• El volumen de mezcla en el reactor se mantiene constante en el tiempo.
• Se aplica una adición continua de medio de cultivo y una retirada continua del cultivo celular del biorreactor.
• El flujo de entrada o adición es igual al flujo de salida o purga.

4. Orden de Procesos: Cristalización, Filtración, Rotoevaporación y Extracción Líquido-Líquido

1. Filtración: Elimina sólidos que interferirían en la extracción.
2. Extracción líquido-líquido: Separa el compuesto deseado según su solubilidad.
3. Rotoevaporación: Elimina el disolvente y concentra el compuesto.
4. Cristalización: Purifica el producto formando cristales.

5. Líneas Celulares Transformadas

Una línea celular transformada es el resultado de un cambio genotípico denominado transformación. Al repetir sucesivos subcultivos se puede obtener una línea celular con las siguientes características:

• Inmortalidad: Crecen indefinidamente.
• Crecimiento aberrante: No hay inhibición por contacto ni dependencia del anclaje.
• Malignidad: Invaden tejidos y forman tumores.
• Inestabilidad genética: Variación en el número de cromosomas (heteroploidía) y aberraciones cromosómicas.

6. Cultivos Celulares Vegetales

Posibilidades de cultivos celulares vegetales que se pueden obtener a partir de:

• Yemas apicales y axilares: Los explantes de meristemos apicales o los explantes de tallos o ramas.
• Yemas adventicias: Los explantes de partes de las hojas, partes del tallo o de la raíz son los elegidos para los procesos de morfogénesis.

7. Cálculo de Actividad Enzimática

100 mg de una enzima cuya actividad enzimática específica es de 5.8333 × 10³ U/mg. La masa molecular del sustrato es de 120 Da.

8,33 × 10⁻⁸ katal/mg.

10⁶ U/kat = 8,33 × 10⁻² U/mg × 100 mg = 8,33 U.

8,33 μmol/min × 30 min = 249,9 μmol.

120 Da = 120 g/mol.

240,9 × 10⁻⁶ mol × 120 g/mol × 10³ mg/g = 29,99 mg.

8. Sustratos en Replicación, Transcripción y Traducción

En la replicación los sustratos que actúan son los desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTPs), en la transcripción los ribonucleósidos trifosfatos (NTPs) y en la traducción los aminoácidos activados.

Secuencia: 3′ TACAAGCATGACGTTCCAACATCCACT-5′.

La secuencia de ARN es 5′-AUGUUCGUACUGCAAGGUUGUAGGUGA-3′.

NH₂ y COOH respectivamente.

9. Confluencia en Cultivos Celulares

Fenómenos que ocurren cuando en un cultivo celular se alcanza la confluencia:

Por un lado, el contacto entre las células hace que ellas mismas inhiban su crecimiento y por otro lado, en este estadio las células muestran propiedades morfológicas y fisiológicas similares a las que mostrarían en el tejido vivo de procedencia.

Mecanismos principales que regulan la senescencia en las líneas celulares: acortamiento de telómeros y activación de check-points en ADN.

10. Callos en Cultivos Vegetales

Las células diferenciadas de un tejido se desdiferencian pasando a un estadio denominado callum o callo. El callo corresponde a un crecimiento celular normalmente de la zona de la periferia del tejido en contacto con el medio del cultivo.

Incorporan glucosa dado que durante la incubación el cultivo es prácticamente heterótrofo, dado que los tejidos u órganos desarrollados pueden efectuar la fotosíntesis en muy reducida medida.

11. Parámetros en la Incubación de Cultivos Microbianos

Principales parámetros a considerar y controlar durante la incubación de los cultivos microbianos: Composición de la atmósfera de incubación (suministro de O₂), temperatura de incubación, luz, y humedad relativa.

En la vía oxidativa el aceptor final de electrones debe ser el oxígeno. El proceso es aerobio y produce poca acidez, mientras que en las vías metabólicas fermentativas el aceptor final de electrones es un compuesto orgánico y el proceso es anaerobio, originando mucha acidez en poco tiempo.

12. Microorganismos Quimioheterótrofos

Un quimioheterótrofo utiliza compuestos orgánicos como fuente de carbono y obtiene su energía a partir de reacciones químicas.

Aerotolerantes, son los que crecen bien en presencia o ausencia de oxígeno. Se observaría crecimiento en todo el tubo, ya que los microorganismos crecerían tanto con presencia como con ausencia de O₂ porque no les daña.

13. Diferencias entre Bacterias y Levaduras

• Bacterias: Son procariotas, unicelulares, más pequeñas (1–5 µm), con pared de peptidoglicano y se reproducen por fisión binaria. Tienen gran diversidad metabólica (aerobias, anaerobias, fermentativas).
• Levaduras: Son eucariotas, unicelulares, más grandes (5–10 µm), con pared de quitina y glucanos, y se reproducen por gemación. Son aerobias facultativas y realizan fermentación.