Técnicas de Identificación Molecular

La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, ya sea de proteínas o de ácidos nucleicos:

• Si se trata de proteínas, la técnica se denomina Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar la banda que presenta la proteína de interés.
• Si se trata de ADN, la técnica se llama Southern blot. Se emplean sondas de ADN (moléculas de ADN marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.
• Si se trata de ARN, la técnica se denomina Northern blot. Se utilizan sondas de ARN (moléculas de ARN marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.

Electroforesis

Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis:

• Con proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida.
• Con ácidos nucleicos se utiliza un gel de agarosa.

Transferencia (Blotting)

Las bandas de proteínas o ácidos nucleicos se transfieren desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa para que puedan reaccionar con la sonda radiactiva.

Autorradiografía

Se añaden anticuerpos radiactivos contra una proteína o sondas radiactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen. La membrana de nitrocelulosa se coloca sobre una placa fotográfica y se revela.

Aplicaciones del Blotting

El Southern blot es una técnica que puede proveer información útil para el diagnóstico molecular de algunas enfermedades génicas.

El Northern blot permite observar un patrón particular de expresión génica entre tejidos, órganos, estadios del desarrollo, niveles de estrés ambiental, infecciones causadas por patógenos y durante el curso del tratamiento de las mismas. Esta técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la desregulación de genes oncosupresores en células cancerosas cuando se comparan con tejidos normales.

El Western blot se usa para detectar enfermedades como el VIH y la enfermedad de las vacas locas.

PCR en Tiempo Real

Se utiliza para amplificar y cuantificar simultáneamente de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Emplea, al igual que la PCR convencional, un molde de ADN y al menos un par de cebadores específicos.

Usos de la PCR

La PCR cuantitativa se utiliza para el diagnóstico de enfermedades, como enfermedades infecciosas, cáncer y anormalidades genéticas.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría, basta partir de una única copia de ese fragmento original (molde).

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN. Su utilidad radica en que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con alta probabilidad virus o bacterias causantes de una enfermedad.

Inmunohistoquímica

Tiene como objetivo detectar, amplificar y hacer visible un antígeno específico, que generalmente es una proteína. Esta técnica permite identificar la localización de una sustancia específica a nivel tisular o celular.

Se basa en la utilización de anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia que se quiere identificar (antígeno primario).

Tinción de Gram

La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen (esputo, orina, pus, etc.) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza un lavado. Si el colorante permanece en la pared bacteriana, se trataría de bacterias Gram positivas (color morado); si se ha ido, la pared tendría un color rosado, indicando bacterias Gram negativas.

Fue diseñada por Christian Gram en 1884 con el objetivo de diferenciar y clasificar diferentes grupos de bacterias.

Aplicación de la Tinción de Gram

Permite identificar bacterias rápidamente en una infección y seleccionar el antibiótico más adecuado para tratarla.

FISH (Hibridación in situ fluorescente)

Es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia, permitiendo la visualización, distinción y estudio de los cromosomas, así como de las anomalías que puedan presentar.

Aplicaciones de FISH

Se utiliza para el análisis de anomalías cromosómicas embrionarias, tanto numéricas como estructurales.