Métodos de Siembra y Cultivo de Microorganismos

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de la muestra (inóculo) en un medio de cultivo adecuado con el fin de iniciar un cultivo microbiano.

Técnica Aséptica en el Laboratorio

La técnica aséptica se refiere a las prácticas que reducen la posibilidad de que los microorganismos contaminantes entren en el material estéril.

Pasos Fundamentales de la Técnica Aséptica

1. Esterilización del ansa en la llama.
2. Retiro del tapón del tubo con ayuda de los dedos meñique e índice.
3. Flameado del extremo del tubo para esterilizar.
4. Introducción del ansa esterilizada en el tubo.
5. Retiro del ansa y flameado del extremo del tubo nuevamente.
6. Tapado del tubo y transferencia del ansa al interior de otro tubo estéril.

Cultivos en Medios Sólidos

Siembra en Picadura o Punción

Esta técnica permite conocer el comportamiento de los microorganismos frente al oxígeno y su movilidad.

Siembras en Estrías

Esta técnica constituye un medio adecuado para el cultivo de microorganismos aerobios y aerobios facultativos.

Siembra por Agotamiento en Estrías

Se obtienen colonias aisladas en las últimas estrías, separadas unas de otras, permitiendo a partir de las mismas la obtención de cultivos puros mediante resiembra en otro medio de cultivo.

Siembra por Espátula de Drigalski

Permite sembrar inóculos sobre superficies grandes para obtener un crecimiento confluente. También puede utilizarse para un recuento de colonias; para cumplir con este último objetivo, previamente se deben realizar diluciones seriadas de la muestra.

Siembra con Hisopo

Esta técnica permite sembrar inóculos abundantes sobre superficies grandes a fin de obtener un crecimiento confluente.

Siembra en Placa

Esta técnica permite el desarrollo de microorganismos aerobios, aerobios facultativos y microaerófilos.

Cultivos en Medios Líquidos

Se lleva el material con ansa en anillo o pipeta a un recipiente (frasco Erlenmeyer o tubo) conteniendo el medio de cultivo líquido. Generalmente, este tipo de siembra se utiliza para aumentar el número de microorganismos.

Influencia del Medio Ambiente Físico en el Crecimiento Microbiano

Temperatura

Las elevadas temperaturas afectan principalmente a las reacciones catalizadas por enzimas.

La dependencia de la temperatura de un microorganismo se caracteriza por sus Temperaturas Cardinales: (mínima, óptima y máxima).

Clasificación de los Microorganismos de Acuerdo a sus Temperaturas Cardinales

• Psicrófilos: Pueden crecer a 0 °C, pero tienen una temperatura óptima de crecimiento de aproximadamente 15 °C. Estos microorganismos rara vez causan problemas en la conservación de los alimentos.
• Psicrótrofos (Psicrófilos Facultativos): Pueden proliferar a 0 °C, pero tienen temperaturas óptimas de crecimiento más elevadas (20 a 30 °C). Son más comunes que los psicrófilos y probablemente están implicados en el deterioro de los alimentos a bajas temperaturas.
• Mesófilos: Presentan una temperatura óptima de crecimiento de 25 a 40 °C. Son el tipo más común de microorganismos y comprenden a aquellos que causan deterioro en los alimentos y enfermedades en el hombre y animales.
• Termófilos: Muchos de ellos tienen una temperatura óptima de 50 a 60 °C y varios no pueden desarrollarse a temperaturas inferiores a los 45 °C. No constituyen un problema en salud pública y son importantes en los montículos de compost.
• Hipertermófilos: En ocasiones son llamados termófilos extremos. Tienen una temperatura óptima de crecimiento de 80 °C o más, y viven en fuentes termales asociadas a la actividad volcánica.

Acidez y Alcalinidad (pH)

Cada microorganismo tiene un intervalo de pH dentro del cual es posible el crecimiento. Además, cada organismo muestra un valor óptimo bien definido de pH para el crecimiento.

• Acidófilos: Crecen entre pH 0 y pH 5 (Acidófilos extremos u obligados). Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas del género Sulfolobus tienen su pH óptimo cercano a 2. De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H⁺ para mantener la integridad de sus membranas y envolturas.
• Neutrófilos: Crecen entre pH 5 y pH 9. Ejemplos: la mayoría de las bacterias (E. coli, Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., etc.).
• Basófilos: Crecen entre pH 8.5 y pH 11.5. Los basófilos obligados tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Ejemplo: Bacillus alcalophilus, cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterium gregoryi).

Oxígeno

Microorganismos Aeróbicos

• Aerobios Estrictos u Obligados: Dependen de la respiración aeróbica para cubrir sus necesidades energéticas. Crecen fácilmente sobre la superficie de placas de agar y en la superficie de los cultivos líquidos en reposo (estáticos). En cultivos líquidos, es necesario airear el cultivo para suministrar la misma concentración de O₂ en todo el cultivo. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y superóxido dismutasa (SOD) para neutralizar las formas tóxicas del O₂. Ejemplos: Micrococcus luteus, Pseudomonas spp.
• Microaerófilos: Son microorganismos aerobios que crecen mejor a presiones parciales de O₂ considerablemente más bajas (0.2 atm) que las presentes en el aire. En medios de cultivo no crecen en la superficie, sino por debajo, donde la concentración de O₂ es menor. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del O₂. Ejemplos: Campylobacter spp., Spirillum volutans.
• Aerobios Facultativos: Pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de O₂, pero lo hacen mejor en presencia, en cuyo caso realizan respiración aeróbica. En medios sin O₂ desarrollan mediante respiración anaeróbica o fermentación.

En los medios de cultivo pueden desarrollarse en todo el tubo, tanto en superficie como en profundidad. Poseen las enzimas catalasa, peroxidasa y SOD para neutralizar las formas tóxicas del O₂. Ejemplo: Escherichia coli.

Microorganismos Anaerobios

¿Por qué el O₂ es tóxico? El O₂ no es tóxico en sí mismo, pero se puede convertir en subproductos tóxicos, que dañan o matan las células que no son capaces de contrarrestar su efecto. Estos productos tóxicos se llaman especies reactivas de oxígeno (O₂^•−, H₂O₂, HO•, etc.).

• Aerotolerantes: No requieren ni crecen en presencia de oxígeno, pero toleran su presencia. Poseen SOD o un sistema equivalente que les permite neutralizar las formas tóxicas del O₂. Ejemplos: Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes.
• Anaerobios Estrictos: Se desarrollan en ausencia de O₂. Realizan respiración anaeróbica o fermentación. Los cultivos líquidos se preparan en tubos o matraces con gran volumen de medio con el agregado de sustancias reductoras, cerrados con tapones de goma o rosca, eliminando el O₂ por ebullición del medio de cultivo, previo a la siembra. El aislamiento en medios sólidos se realiza mediante la incubación de las cajas de Petri en jarras anaeróbicas de cierre hermético. Carecen de enzimas para neutralizar las formas tóxicas del O₂. Ejemplos: Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium.

Disponibilidad de Agua

La disponibilidad de agua no solo depende de la humedad del ambiente, sino que también es función de la concentración de solutos disueltos en el agua presente. Los solutos captan agua y la dejan menos disponible para los organismos.

La disponibilidad de agua se expresa como actividad de agua (a_w).

• Medios Hipotónicos: La a_w en el exterior > a_w que la del citoplasma.
• Medios Hipotónicos: La a_w en el exterior w que la del citoplasma. (ta asi en power) [Nota del editor: Se mantiene el texto original, aunque la segunda definición es redundante e incompleta.]

Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los halófilos.

• Sacarófilos: Viven en ambientes con altas concentraciones de azúcares. Por ejemplo, las levaduras.
• Halófilos: Viven en ambientes con altas concentraciones de sales.

Radiaciones

Radiación UV

Para que se establezca el efecto de la luz UV sobre los microorganismos, estos deben estar expuestos en forma directa. Cuando el procedimiento no es correcto, desciende la tasa de muerte y aumenta el número de mutaciones en el genoma bacteriano. Muchos microorganismos tienen enzimas reparadoras que reparan el daño inducido en el ADN por la radiación ultravioleta.

Radiación Infrarroja

Las ondas infrarrojas poseen poco poder de penetración y, al parecer, no matan a los microorganismos directamente. Sin embargo, la absorción de tales radiaciones da como resultado un incremento en la temperatura, exponiendo los microorganismos a temperaturas más elevadas que sus temperaturas óptimas de crecimiento.