1. Sistemas de Biorreactores: Perspectiva Operativa

Desde el punto de vista operativo, los biorreactores se clasifican en tres tipos según el flujo de entrada y salida:

• Discontinuo (Batch):

  No hay alimentación ni salida durante el proceso. Se carga todo el medio al inicio, se inocula y se deja evolucionar hasta completar el cultivo.

• Semicontinuo (Fed-Batch):

  Hay alimentación continua o por etapas, pero no hay salida. Se usa para prolongar la fase de crecimiento exponencial y aumentar la productividad.

• Continuo (Quimiostato):

  Hay alimentación y salida constantes. Permite mantener condiciones estables (estado estacionario) y producción continua.

4. Balances de Masa: Continuo, Discontinuo y Semicontinuo

Elementos en un proceso de biorreacción:

✔️ 1. Elemento Biológico

• Biocatalizador:

  • Microorganismos (bacterias, hongos, levaduras)

  • Células animales o vegetales

  • Enzimas libres o inmovilizadas

  • Orgánulos (mitocondrias, cloroplastos)

✔️ 2. Sustrato o Medio de Cultivo

• Proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento del biocatalizador.

• Componentes:

  • Fuente de carbono (glucosa, lactosa)

  • Fuente de nitrógeno (sales amoniacales, peptonas)

  • Sales minerales

  • Factores de crecimiento, vitaminas

✔️ 3. Biorreactor (Recipiente de Reacción)

• Contenedor estéril donde se lleva a cabo el proceso biológico.

• Controla variables como:

  • pH

  • Temperatura

  • Oxígeno disuelto

  • Agitación y aireación

  • Espuma

  • Presión

✔️ 4. Sistemas de Control y Monitoreo

• Sensores y actuadores que permiten mantener condiciones óptimas:

  • Sensor de pH

  • Sensor de temperatura

  • Sensor de oxígeno (OD)

  • Controlador de espuma

  • Control de flujo de aire y nutrientes

  • Bombas peristálticas (dosificación de ácido, álcalis, antiespumantes)

✔️ 5. Sistema de Recuperación y Purificación del Producto

• Procesos posteriores a la biorreacción para extraer y purificar el producto:

  • Ruptura celular (si el producto es intracelular)

  • Clarificación

  • Concentración

  • Purificación

  • Formulación final

Modelos Operativos / Clasificación Operativa / Partes del Biorreactor

Clasificación operativa de biosensores (modelos operativos): Los biosensores pueden clasificarse según distintos criterios:

• Por tipo de interacción entre el analito y el bioreceptor.

• Por el método de detección (electroquímico, óptico, etc.).

• Por la naturaleza del bioreceptor (enzima, anticuerpo, etc.).

• Por el tipo de transductor.

Partes elementales del biosensor (equivalente funcional a un biorreactor miniaturizado):

1. Elemento de reconocimiento biológico (bioreceptor):

   • Ejemplos: Enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, células, tejidos, receptores, etc.

2. Sistema de inmovilización:

   • Fijación del bioreceptor a una matriz o membrana.

   • Técnicas: adsorción, atrapamiento, enlaces covalentes, etc.

3. Transductor:

   • Convierte la señal bioquímica en señal eléctrica.

   • Tipos: Electroquímicos, ópticos, piezoeléctricos, termométricos, nanomecánicos.

4. Sistema de detección y lectura:

   • Procesamiento de la señal para cuantificar o identificar el analito.

Concepto de Biosensor

Un biosensor es un dispositivo compacto de análisis que integra un elemento de reconocimiento biológico o biomimético con un sistema de transducción que convierte la interacción entre analito y receptor en una señal medible.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Basada en:

• Amplificación de fragmentos específicos de ADN a partir de cebadores complementarios.

• Uso de una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa).

• Requiere ciclos de temperatura en un termociclador.

Etapas básicas:

1. Desnaturalización (94-95°C): Separación de cadenas de ADN.

2. Alineamiento de cebadores (≈64°C).

3. Extensión/síntesis (72°C): Replicación del fragmento objetivo.

Concepto: Técnica que permite amplificar regiones específicas de ADN de forma exponencial mediante ciclos térmicos, siendo muy útil para detectar secuencias genéticas mínimas en muestras complejas.

Concepto de ELISA

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) es una técnica inmunológica que se basa en la unión específica antígeno-anticuerpo y en la acción catalítica de una enzima unida al anticuerpo o antígeno para generar una señal detectable, usualmente un cambio de color.

📊 Clasificación de los Biosensores

1. Biocatalíticos

• Se basan en enzimas o sistemas vivos (enzimas, células, tejidos).

• El analito es transformado químicamente por el biocatalizador.

• La señal se produce al formarse o desaparecer un producto o sustrato.

📌 Ejemplo: Detección de glucosa por glucosa oxidasa.

2. De Bioafinidad

• No transforman al analito, solo se unen específicamente a él.

• Se forma un complejo analito-receptor (por afinidad).

• Usa elementos como anticuerpos, lectinas, ácidos nucleicos, aptámeros.

• La señal es el resultado de esta unión.

📌 Ejemplo: Test ELISA, detección de OGM.

⚖️ Diferencia entre Catalíticos y de Afinidad

🧪 ¿Qué es PCR?

PCR (Reacción en cadena de la polimerasa): técnica que amplifica regiones específicas de ADN mediante ciclos térmicos, utilizando una ADN polimerasa termoestable (como Taq).

🔧 Elementos necesarios:

• ADN molde.

• Primers (cebadores): marcan el inicio del ADN a copiar.

• ADN polimerasa termoestable (ej: Taq).

• dNTPs: nucleótidos libres.

• Iones Mg²⁺: cofactor.

• Buffer (tampón).

• Calor/Termociclador.

🔁 ¿En qué consiste PCR?

1. Desnaturalización (94–95°C): separación de cadenas del ADN.

2. Alineamiento (≈64°C): unión de los primers al ADN molde.

3. Extensión (72°C): la polimerasa sintetiza ADN nuevo desde los primers.

🔁 Este ciclo se repite muchas veces (20–40), generando millones de copias.

💡 Aplicaciones de PCR

• Identificación de OGM.

• Autentificación de especies (cárnicos, pesqueros, vegetales).

• Detección de microorganismos (bacterias, virus).

• Control de fraudes en alimentos.

🔄 PCR Múltiple

Variante de PCR donde se usan varios pares de primers en una sola reacción, para detectar diferentes genes/analitos al mismo tiempo.

🔹 Permite analizar varias dianas simultáneamente.
🔹 Útil en identificación múltiple de especies o detección de varios microorganismos.

🧬 Etapas PCR (esquema pag. 17)

1. Desnaturalización: separación de cadenas de ADN (~95°C).

2. Alineamiento: primers se unen (~64°C).

3. Extensión: polimerasa copia ADN (~72°C).

⚡️ Electroforesis

🔬 ¿Qué es y para qué sirve?

Es una técnica de separación de ácidos nucleicos (ADN o ARN) basada en su tamaño y carga. Se usa para:

• Verificar productos de PCR.

• Estimar el tamaño de fragmentos de ADN.

• Confirmar pureza y cantidad de ADN/ARN.

⚙️ Principio de funcionamiento:

• El ADN y ARN tienen carga negativa, por lo que migran hacia el ánodo (polo positivo) en un campo eléctrico.

• La velocidad de migración depende del tamaño (los + pequeños se mueven + rápido) y de la conformación (superenrollados vs. lineales).

• Los fragmentos se separan en un gel (agarosa o acrilamida) que actúa como tamiz molecular.

🧪 ¿Qué necesitamos para hacer una electroforesis?

📌 TAE vs. TBE:

📏 Disposición de geles:

• ADN: Geles horizontales.

• ARN: Geles verticales (por ser + sensibles y requerir mejor resolución).

🌈 Espectrofotometría (Cuantificación de ADN)

🔬 ¿Qué mide?

Mide la absorbancia de luz ultravioleta por los ácidos nucleicos para calcular su concentración y pureza.

📏 Longitudes de onda clave:

🔬 ¿Qué es la qPCR?

La qPCR (quantitative PCR) o PCR en tiempo real es una variante de la PCR convencional que permite detectar y cuantificar ADN a medida que se amplifica, en tiempo real, gracias a la fluorescencia emitida durante el proceso.

⚙️ ¿En qué se fundamenta?

Se basa en los mismos principios y componentes que la PCR normal, pero con la incorporación de fluoróforos que permiten medir la fluorescencia proporcional a la cantidad de ADN amplificado.

🧪 Componentes necesarios (iguales a PCR normal):

• ADN molde

• Cebadores (primers) específicos de la región a amplificar

• dNTPs (nucleótidos libres)

• ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa)

• Iones Mg²⁺ y buffer

• Termociclador especial con detección de fluorescencia

🌟 Diferencia Principal: Uso de Fluoróforos

La qPCR incorpora fluoróforos que emiten luz fluorescente cuando se amplifica el ADN.
🔹 La intensidad de la fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN presente en cada ciclo.

Cuanta + fluorescencia se emite → + ADN hay → mayor concentración de muestra inicial.

🔦 Tipos de Fluoróforos que Debes Recordar

📌 No es necesario saber cómo funcionan internamente, solo recordar sus nombres y que son específicos de qPCR.

📈 ¿Qué Mide la qPCR?

• Mide la fluorescencia emitida en cada ciclo.

• Según la intensidad, se deduce cuánto ADN hay.

• Permite hacer cuantificación absoluta (con estándar) o relativa (comparativa).

conclusión: a – adn + ciclos necesito para llegar a ese valor de referencia CT y a + AND – ciclos.

Nct = Ni x 2^ct

NCT= Cantidad de ADN que tengo al llegar a ese valor de fluorescencia

Ni= Cantidad de ADN inicial

CT= Ciclo de fluorescencia de referencia

Explicación de la gráfica y de la fórmula

y = -a X + b