Biomoléculas y Macromoléculas Fundamentales

Las biomoléculas se encuentran en todos los seres vivos, con una estructura basada en átomos de carbono. Están formadas a partir de monómeros.

Las macromoléculas biológicas principales son:

• Carbohidratos
• Lípidos
• Proteínas
• Ácidos nucleicos

Carbohidratos (CHO)

Son la principal fuente de energía de los seres vivos. Incluyen glucógeno y almidón para almacenamiento.

Tipos de Carbohidratos:

• Monosacáridos: Glucosa, fructosa, galactosa, ribosa.
• Oligosacáridos: Lactosa, sacarosa, maltosa, rafinosa, ciclodextrinas.
• Polisacáridos: Almidón, glucógeno y celulosa.

Proteínas

Se forman por la unión de aminoácidos mediante enlaces peptídicos. Son las macromoléculas más abundantes.

Existen proteínas estructurales, catalíticas, hormonales, de reserva y de defensa.

Lípidos

Componen las membranas celulares, son hidrofóbicos y sirven como almacén energético.

Ácidos Nucleicos

Son polímeros formados por monómeros (nucleótidos). Contienen azúcar, base nitrogenada y fosfato. Son fundamentales en el dogma central de la biología molecular.

Conceptos Clave en Biotecnología y Bioprocesos

Biotecnología

Aprovecha los procesos biológicos y los utiliza para beneficio del ser humano.

Bioprocesos

Todo proceso industrial que involucra la manipulación de organismos vivos.

Técnicas de Separación: Centrifugación

Centrifugación

Proceso mecánico que involucra el uso de una fuerza centrífuga para separar los componentes de una mezcla.

Tipos de Centrifugadoras por Velocidad:

• Centrífuga de baja velocidad: 4-5 mil rpm, para separación de células grandes.
• Centrífuga de alta velocidad: Velocidades de 18-25 mil rpm, para fracciones celulares.
• Ultracentrífuga: Superan los 50 mil rpm, requieren refrigeración y alto vacío.

Tipos de Rotores:

• Rotor flotante: Las carcasas flotan por el campo centrífugo.
• Rotor angular: Los tubos forman un ángulo con el eje vertical.
• Rotor vertical: Tubos verticales, para análisis de mayor volumen, con perforaciones para los tubos.

Aplicaciones de la Centrifugación:

• Analítica: Determinación de parámetros moleculares.
• Preparativa: Separación de los componentes de una muestra en grandes volúmenes.

Técnicas de Centrifugación Avanzadas:

• Proceso de fraccionamiento diferencial: Conjunto de etapas encaminadas a conseguir la máxima separación.
• Gradiente de densidad: Implica la utilización de un soporte fluido.
• Centrifugación zonal: Separa en bandas en función del coeficiente de sedimentación.
• Centrifugación isopicnica: Separación basada en la diferencia de densidades.
• Uso de gradientes: Sirve para reducir la velocidad de las partículas que se mueven más rápido.

Fuerza Centrífuga Relativa (RCF)

Es la cantidad de aceleración que se aplicará a la muestra.

Estructuras Celulares Relevantes:

• Membrana plasmática: Forma el límite biológico de la célula, modelo de mosaico fluido.
• Pared celular: Estructura rígida y compleja, proporciona resistencia estructural.

Métodos de Disrupción Celular

Métodos Mecánicos

Aplican fuerza para romper las células. Generan altas temperaturas, por lo que pueden dañar los productos.

• Mortero: Conocido como triturador de tejido.
• Molino de perlas: Utiliza perlas de cerámica o minerales. La suspensión se agita vigorosamente mediante un agitador de discos sobre un motor central.
• Ultrasonido: Aplicación mecánica de ondas de alta frecuencia, a menudo con una punta de titanio.
• Cavitación: Proceso de nucleación, crecimiento y colapso de burbujas.
• Colapso: Convierte la energía sónica en energía mecánica.
• Homogenización de alta presión: Trabaja forzando a las células en suspensión a través de un canal estrecho bajo presión.

Métodos No Mecánicos

Incluyen métodos químicos, enzimáticos y físicos.

• Químicos: Interacción selectiva con los componentes de la membrana o pared celular para potenciar la liberación del producto (ej. detergentes).
• Método enzimático: Hidrolizan la pared celular de microorganismos. Método muy preciso.
• Autólisis: Proceso por el cual las células inducen su propia destrucción.
• Termólisis: Las células son llevadas a altas temperaturas con el fin de romper la pared celular.

Espectroscopia y sus Aplicaciones

Espectroscopia

Técnica de análisis molecular basada en el estudio de las interacciones que se establecen entre las radiaciones electromagnéticas y la materia.

Radiación Electromagnética (REM)

Es una forma de energía que se transmite por el espacio a gran velocidad sin necesidad de soporte material.

Espectro Electromagnético

Abarca un intervalo muy amplio de longitudes de onda.

Absorción

Proceso por el cual una especie, en un medio, capta selectivamente ciertas frecuencias de la radiación electromagnética. Tiene como ventaja producir poca o ninguna alteración en el sistema estudiado.

Espectroscopia de Absorción

Técnica que analiza las transiciones electrónicas de una molécula.

Transiciones Energéticas

En un enlace entre dos átomos, dos orbitales atómicos dan lugar a dos orbitales moleculares:

• Orbital enlazante: Menor energía.
• Orbital antienlazante: Mayor energía.

Ecuación de Lambert

λ Io c I

Cromóforo

Estructura capaz de absorber radiación electromagnética.

Leyes Fundamentales de la Espectroscopia de Absorción

• Ley de Lambert: Predice el efecto que produce el espesor del medio-muestra sobre la fracción de radiación que absorbe.
• Ley de Beer: Establece el efecto de la concentración del medio-muestra sobre la fracción de radiación que absorbe, comúnmente usada para determinar concentraciones de una muestra desconocida.

Espectrofotómetro

Mide la absorción de luz a través de una muestra.

Componentes del Espectrofotómetro:

• Fuente de luz
• Sistema de colimación
• Monocromador
• Rendija
• Compartimiento para cubetas
• Detector

Monocromador: Sistema que permite descomponer luz policromática en toda la gama de frecuencias que la forman (similar a un prisma).

Detector: Su función es convertir la respuesta del instrumento en una señal medible.

Secuencia de Funcionamiento:

• Lámpara
• Lente
• Monocromador
• Selector
• Cubeta con muestra
• Fotodetector
• Pantalla digital

Espectrofotometría de Proteínas

Proteínas

Constituidas por aminoácidos (aa) unidos por enlaces peptídicos, que contienen grupos carboxilo y amino.

Cromóforos en Proteínas:

• Enlace peptídico: Cromóforo más importante de una proteína (190-200 nm), su banda de absorción es la más intensa del espectro.
• Cadenas laterales de aminoácidos: Bandas de absorción más significativas en el intervalo de longitudes de 260 a 290 nm (aminoácidos aromáticos).
• Grupos prostéticos: Bandas de absorción en la región visible, útil para identificar proteínas coloreadas.

Efectos de Desplazamiento Espectral:

• Batocromismo: El espectro se desplaza a mayores longitudes de onda (hacia el rojo, a la derecha).
• Hipsocromismo: El espectro se desplaza a menores longitudes de onda (hacia el azul, a la izquierda).

Aplicaciones de la Espectrofotometría de Absorción UV-Visible al Estudio de Proteínas:

Es una herramienta versátil para:

• Detectar proteínas
• Cuantificar
• Estudiar desnaturalización y renaturalización
• Unión de ligandos

Cuantificación de proteínas: Para preparaciones homogéneas, utilizando el coeficiente de extinción y la ley de Lambert-Beer.

Estudio de desnaturalización-renaturalización: Al desnaturalizarse una proteína…

Fd= Ci/Cf. Vf= 10ml Vf=100ml

Reflejo espectroscópico: La mayoría de los cromóforos estarán en un entorno más polar, desplazándose hacia el azul. La renaturalización implicará un cambio opuesto.

Unión de ligandos: Importante para medir afinidad y características de interacción, con un efecto directo por el contacto entre el cromóforo y el ligando.

Espectrofotometría de Ácidos Nucleicos

Caracterización de propiedades ópticas de las bases nitrogenadas (A, G, C, T, U). Banda de absorción principal a 260 nm.

Efectos Hipercrómico e Hipocrómico:

• Hipercromismo: Cuando el polímero absorbe más que la suma de las absorbancias de sus monómeros constituyentes.
• Hipocromismo: Efecto contrario, el polímero absorbe menos.

Aplicaciones:

• Detección: Se detecta registrando a 260 nm.
• Cuantificación
• Pureza
• Estructura
• Interacción con ligandos
• Interacción con proteínas

Pureza: Detección más específica si se obtiene el espectro completo de la disolución estudiada.

Los ácidos nucleicos están implicados en muchos procesos fundamentales que tienen lugar en la célula.

Fluorescencia

Fluorescencia

Fenómeno de emisión de luz. Su estudio proporciona información cualitativa y cuantitativa sobre aspectos estructurales de la molécula.

El camino más probable hacia el estado fundamental es aquel que minimiza el tiempo de vida del estado excitado.

Procesos de Desactivación:

• No radiativa: Tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente.
• Radiativa: Basada en la emisión de radiación electromagnética por moléculas que previamente han sido excitadas.

Conceptos Clave en Fluorescencia:

• Desplazamiento de Stokes: Diferencia de la longitud de onda que existe entre el máximo de emisión y el máximo de excitación.
• Rendimiento cuántico: Relación entre el número de fotones emitidos por fluorescencia y el número total de fotones absorbidos.

Espectros de Fluorescencia:

• Espectros de emisión: Los fotones emitidos pueden tener distintas longitudes de onda de emisión.
• Espectros de excitación: Analiza la emisión fluorescente a una única longitud de onda, excitando a diferentes longitudes.

Componentes del Fluorímetro:

• Fuente de luz: Provoca la excitación de la muestra.
• Monocromador: Selecciona la longitud de onda.
• Detectores: Fotomultiplicadores que detectan la emisión de fotones por el fluoróforo.

Fluoróforo

Molécula o parte de una molécula que puede emitir fluorescencia. Solo aquellos que absorben en el UV próximo.

Influencia del Entorno

Un desplazamiento hacia el rojo (derecha) indica un entorno más polar. Un desplazamiento hacia el azul (izquierda) indica un entorno más apolar.

Fluorescencia en Ácidos Nucleicos

Los ácidos nucleicos no poseen fluoróforos intrínsecos significativos debido a las bajas propiedades fluorescentes de sus bases nitrogenadas.