Producción de Proteínas Recombinantes: Sistemas y Vectores

La producción de proteínas recombinantes requiere vectores específicos. Un vector ideal debe poseer:

• Un origen de replicación (ori) y un marcador de selección para E. coli.
• Un ori en eucariotas y un marcador seleccionable.
• Un promotor en eucariota.
• Sitio de clonación, ATG (codón de inicio) y señales de stop transcripcionales y traduccionales.
• Región Kozak y secuencia que permite la poliadenilación del mensajero.

Sistemas de Expresión en Levaduras

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae es un organismo unicelular cuya genética y fisiología son bien conocidas. Presenta las siguientes características:

• Se conocen varios promotores de la levadura y un plásmido natural.
• Lleva a cabo muchas modificaciones postraduccionales.
• Ha sido muy utilizado y no requiere tantos estudios.

Vectores de levaduras: Yeps (basados en plásmidos de 2 micras, los más usados), Ylps (plásmidos que se integran) y Yacs.

Desventajas de Saccharomyces: Puede tener baja expresión y producción modesta, la proteína de interés puede no secretarse y produce etanol.

Pichia pastoris

Ventajas de Pichia pastoris:

• Tiene un promotor descrito y regulado (promotor AOX1).
• En presencia de metanol, el 30% de las proteínas producidas son alcohol oxidasa; en ausencia, no produce esta proteína.
• Se puede cultivar a altas concentraciones.
• Secreta también pocas proteínas endógenas, facilitando la purificación.

DNA Fingerprinting: Identificación Genética

El DNA fingerprinting (huella genética) es una técnica que detecta diferencias genéticas entre individuos de la misma especie.

Fundamento: Se basa en la existencia de repeticiones no codificantes en los loci de los cromosomas, conocidas como microsatélites y minisatélites. Estas repeticiones varían en número entre individuos (polimorfismo) pero no tienen influencia biológica. Durante la replicación, el número de estas repeticiones puede variar entre personas.

Métodos de Análisis:

1. Análisis por Enzimas de Restricción: Se separan las cadenas de ADN y se hibridan con sondas específicas para obtener un patrón de bandas característico.
2. PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): Se utiliza la técnica llamada RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). En este tipo de PCR se emplea un único cebador (oligonucleótido) que, debido a su pequeño tamaño, se une al ADN al azar en múltiples sitios, permitiendo la amplificación de fragmentos polimórficos.

Métodos de Obtención de Vacunas: De lo Tradicional a la Ingeniería Genética

Vacunas Tradicionales

1. Vacunas Enteras Inactivadas: Se emplea el agente infeccioso intacto, el cual no puede producir la enfermedad porque ha sido tratado con algún agente químico o físico.
2. Vacunas Enteras Atenuadas: Se emplea el agente infeccioso debilitado, que produce una afección leve pero mantiene su capacidad inmunogénica.
3. Vacunas de Subunidades: Contienen solo algún componente específico del agente infeccioso. Este componente se extrae, separa, selecciona y purifica por su capacidad para inducir una respuesta inmune protectora.

Vacunas de Nueva Generación y Recombinantes

Vacunas Antiidiotípicas

El idiotipo es la parte del anticuerpo que se une a un determinado epítopo. Se crean anticuerpos contra este idiotipo, resultando en un anticuerpo que imita la estructura del epítopo original. Estos anticuerpos anti-idiotípicos se emplean para vacunar.

Vacunas de Péptidos Sintéticos

Basadas en la síntesis química de péptidos que reproducen alguno de los epítopos de los antígenos del agente infeccioso. Los péptidos son inoculados mezclados con sustancias que potencian la respuesta inmune (adyuvantes).

Vacunas Recombinantes Vivas

Se insertan genes de un agente infeccioso en el genoma de un microorganismo (vector vivo). Este microorganismo expresará las proteínas del patógeno e inducirá una respuesta inmune. Ejemplo: El uso de Vaccinia, un poxvirus, cuyo ADN se replica en el citoplasma de la célula infectada.

Vacunas de Subunidades Recombinantes

Se identifica el componente del patógeno que puede producir anticuerpos (ej. la glicoproteína D de la envoltura del virus del herpes). El gen se clona y se transfecta en células como las CHO. A menudo, se elimina el dominio transmembrana de la proteína para asegurar su secreción, facilitando la purificación. Al inocular esta proteína purificada, se induce inmunidad.

Vacunas Atenuadas por Ingeniería Genética

Son altamente eficaces. Permiten introducir múltiples cambios puntuales que disminuyen la probabilidad de reversión al carácter salvaje, o cambios genéticos más drásticos como la eliminación de un gen o parte de este (deleción). Se emplea ingeniería genética creando un plásmido que contenga la deleción y se introduce en la bacteria para que recombine con su cromosoma.

Vacunas de Ácidos Nucleicos (ADN/ARN)

Se inocula un fragmento de ADN o ARN (o un plásmido) que codifica el antígeno de interés bajo el control de un promotor eucariota. Una vez inoculado, el plásmido es captado y expresado por las células, produciendo el antígeno e induciendo una respuesta inmune.

Microarrays: Plataformas de Alto Rendimiento

Un microarray es un dispositivo sobre cuya superficie se dispone un gran número de entidades diversas para ser evaluadas simultáneamente en un único ensayo.

Microarrays de ADN (Chips de ADN)

Las entidades inmovilizadas son fragmentos de ADN. Se basan en la detección de la expresión diferencial de genes (por ejemplo, entre una célula normal y una defectuosa), ya que ambas muestras hibridan de manera diferente.

Procedimiento:

1. Se extrae el ARNm de cada tipo de célula.
2. Se sintetiza ADN complementario (ADNc) a partir del ARNm.
3. Se añade un marcador de fluorescencia diferente a cada muestra de ADNc.
4. Las muestras se disponen en el microarray y se analiza el patrón de colores resultante para determinar los niveles de expresión.

Microarrays de Proteínas

Existen porque las proteínas son las que llevan a cabo las funciones celulares. Su desarrollo presenta desafíos:

• Deben ser generados uno a uno.
• El reconocimiento puede ser deficiente.
• Pueden ocurrir reacciones cruzadas con otras proteínas.
• Es necesario adherir anticuerpos al soporte.
• No se cubren todas las proteínas del proteoma.

Tipos importantes de microarrays de proteínas:

• Microarrays de Autoantígenos Recombinantes: Se utilizan para determinar si el individuo posee anticuerpos contra el antígeno introducido.
• Microarrays de Anticuerpos Monoespecíficos: Son anticuerpos antipoliclonales diseñados por ordenador y específicos para un conjunto de epítopos concretos de una proteína.

MSP: Detección de Metilación por PCR Específica

MSP (Methylation-Specific PCR) es una técnica que detecta si ciertas citosinas están metiladas utilizando la PCR.

Fundamento:

1. La secuencia de ADN se trata con bisulfito sódico.
2. El bisulfito sódico convierte las citosinas no metiladas en uracilo.
3. Si la citosina está metilada, la transformación a uracilo no se produce.
4. Se realiza una PCR utilizando cebadores específicos para la secuencia metilada y cebadores específicos para la secuencia no metilada (convertida).

Interpretación: Si se obtiene producto de PCR con los cebadores para la secuencia no metilada, significa que las citosinas originales no estaban metiladas (se convirtieron en uracilo). Si se obtiene producto con los cebadores para la secuencia metilada, significa que las citosinas originales estaban protegidas por la metilación.