Técnicas de Hibridación

Las técnicas de hibridación varían según el medio o soporte utilizado. Pueden ser:

• Soporte Sólido: Se caracteriza porque las secuencias diana o la sonda se inmovilizan en un soporte sólido previo a la hibridación.
• Medio Líquido: Se caracteriza porque el híbrido sonda-diana se forma en solución (por ejemplo, en placa de microtiter) para luego fijar a la pared del pocillo para su detección.
• Hibridación In Situ (ISH): La hibridación se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de tejidos y se analiza al microscopio.

Hibridación en Soporte Sólido

Dot Blot

Técnica simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido. Permite detectar secuencias de ADN o ARN en mezclas complejas sin aportar información sobre el tamaño. Permite el estudio de varias muestras a la vez, una en cada zona de la membrana. Se utilizan sondas marcadas con haptenos o isótopos radiactivos.

• Banda/Slot Blot: Las muestras se aplican en forma de banda o ranura.
• Círculos/Dot Blot: Las muestras se aplican en forma de puntos circulares.

Protocolo Genérico de Hibridación en Soporte Sólido

1. Aplicación de la Membrana al Soporte: Se humedece la membrana de nitrocelulosa o nailon en tampón durante 10 minutos y se retira el exceso de tampón con papel de filtro. Se monta en un sistema de vacío.

• Para ADN: Se desnaturaliza con NaOH y EDTA a 100ºC, se neutraliza y se aplica el vacío.
• Para ARN: Igual que para ADN, pero con una solución de NaOH menos concentrada.

Luego, secar a 80ºC. Las membranas de nailon se irradian con luz ultravioleta para anclar los ácidos nucleicos a la membrana.

Prehibridación: Las membranas de nitrocelulosa o nailon se incuban con solución de prehibridación para bloquear uniones inespecíficas. Hibridación: Se introduce la membrana en la solución de hibridación y se incuba de 2 a 24 horas. Lavado de Poshibridación: Se realizan 2 o 3 lavados con diferentes soluciones. Detección del Híbrido: Se utiliza marcaje radiactivo (autorradiografía, placa de rayos X) o haptenos (detección cromogénica).

Aplicaciones del Dot Blot

1. Como Técnica de Rastreo:
   • Detectar ARNm en células tumorales (estudio de expresión génica).
   • Detectar secuencias extrañas en muestras biológicas (virus, bacterias).
2. Aplicaciones Específicas:
   • ASO Dot Blot: Se amplifica el gen de la muestra mediante PCR para obtener miles de copias y se fija en la membrana. Luego se hibrida con oligonucleótidos específicos de alelo, que son sondas específicas para el alelo.
   • Dot Blot Inverso: Se inmovilizan en la membrana los oligonucleótidos específicos de alelo sin marcar. Se marca la muestra en el caso del gen de interés.

Southern Blot

Técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon. Permite detectar secuencias de muchos tamaños. Se utilizan sondas marcadas con radioisótopos.

Protocolo Base del Southern Blot

1. Digestión Enzimática: Con enzimas de restricción.
2. Electroforesis en Gel: Con el objetivo de separar las moléculas por tamaño y carga.
3. Transferencia: A una membrana.
4. Identificación: De un fragmento específico de ADN con una sonda.

Aplicaciones del Southern Blot

• Elaboración de huellas genéticas.
• Detección de mutaciones estructurales.
• Detección de secuencias adquiridas (virus, etc.).

Northern Blot

Técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ARN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nailon. No requiere digestión enzimática porque se parte de ARN purificado.

Protocolo del Northern Blot

1. Electroforesis en Gel: Separar moléculas por su tamaño y carga. Antes de cargar el ARN en el gel, diluir con tampón formamida.
2. Transferencia: A una membrana. No requiere desnaturalización previa del ARN.
3. Identificación: De un fragmento específico de ARN mediante la utilización de una sonda.

Aplicaciones del Northern Blot

• Análisis de la expresión genética.
• Detección de mutaciones.
• Estudios de corte y empalme (splicing alternativo).

Microarrays

Son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN o ADNc distintos, fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico). En cada círculo del chip hay miles de fragmentos del mismo ADN. Se marcan con fluorocromos.

Protocolo de Microarrays

1. Marcaje de la muestra.
2. Hibridación y lavados de poshibridación.
3. Lectura del microarray.
4. Análisis e interpretación del resultado.

Aplicación de los Microarrays

Permiten detectar e identificar alteraciones genéticas como deleciones o duplicaciones del material genético por comparación del ADN de una muestra con ADN de referencia.

• Puntos Rojos: Indica deleción de un segmento de ADN en la muestra problema (se ha unido mayoritariamente ADN de referencia).
• Puntos Verdes: Indica duplicación de un segmento de ADN en la muestra problema (se ha unido mayoritariamente ADN del paciente).
• Puntos Amarillos: Se han unido en la misma proporción ADN de la muestra y de referencia (no hay alteración en ese segmento).

La sensibilidad permite detectar microdeleciones y microduplicaciones de 5-10 kb. Técnica útil para el estudio genómico de células tumorales y en el diagnóstico de enfermedades genéticas.

• Punto Negro: No se expresa ni en el paciente ni en el control.
• Punto Naranja: Gen infraexpresado en el paciente.
• Punto Marrón: Gen sobreexpresado en el paciente.

Hibridación en Medio Líquido

Técnica de Captura de Híbrido

Se basa en la formación de híbridos ADN/ARN que serán reconocidos y capturados por anticuerpos específicos. La secuencia buscada (diana) puede ser ARN (sonda ADN) o ADN (sonda ARN). La captura del híbrido se produce mediante anticuerpos fijados en pocillos de una placa de microtitulación.

Hibridación In Situ (ISH)

Ventajas de la ISH

• No requiere extracción ni purificación de ácidos nucleicos.
• Se puede realizar sobre tejidos en fresco, congelado o fijado en formol.
• Utiliza sondas no radiactivas.
• Es rápida, sencilla y de coste moderado.

Esta técnica permite detectar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos sobre preparaciones cromosómicas, extensiones citológicas o cortes ultrafinos para estudio microscópico.

Preparación de Tejido para ISH

1. Cromosomas en Metafase: Cultivos de sangre periférica, médula ósea, líquido amniótico, deteniendo las mitosis en metafase.
2. Núcleos Interfásicos Desnudos: Núcleo sin condensar. Se obtienen extensiones de núcleos interfásicos de sangre periférica o médula ósea mediante:

• Choque Hipotónico: Por debajo del 0,9% hasta que los leucocitos y hematíes se hinchen.
• Fijación: Mediante la cual los hematíes se lisan y los leucocitos se endurecen.
• Extensión de Núcleos: Dejando caer las gotas desde 30 cm; al chocar con el portaobjetos, quedan extendidos.

Extensiones Citológicas: A partir de fluidos biológicos, fijándolas en etanol frío. Secciones de Tejido: Cortar en finas secciones.

FISH (Hibridación In Situ Fluorescente)

Se basa en el empleo de sondas con fluorocromos, detectables al microscopio de fluorescencia. Se utiliza para detectar alteraciones cromosómicas, tanto numéricas como estructurales.

Protocolo Genérico de FISH

1. Hibridación: Añadiendo la sonda directamente sobre la preparación y cubriendo con un cubreobjetos. Se calienta en placa calefactora para desnaturalizar el ADN (temperatura y tiempo específicos, ej. 37-42ºC durante 12-16h).
2. Lavado de poshibridación.
3. Contratinción: Se realiza con DAPI (colorante que permite visualizar la cromatina).
4. Observación al microscopio de fluorescencia.

FISH Interfásica

Consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase sobre núcleos desnudos, en extensiones citológicas o secciones de tejido. Usa dos tipos de sondas:

• Sonda Centromérica (CEPx): Siendo ‘x’ el número del cromosoma con el que hibrida esa sonda. Se emplean para detectar aneuploidías y poliploidías.
• Sondas Específicas de Locus: Son concretas de un cromosoma en patologías específicas. Para el estudio de anomalías numéricas, pero también translocaciones, microdeleciones y microamplificaciones.

Tipos de Sondas Específicas de Locus

• Sondas de Separación (Split): Para translocaciones no recíprocas. Se emplean cuando se conoce el cromosoma que pierde el fragmento, pero no se conoce a qué cromosoma va el fragmento. Dos sondas marcadas en verde y en rojo que hibridan a ambos lados del punto de rotura en el cromosoma que se sabe que está implicado en la translocación.
• Sonda de Fusión: Se fusiona con otra sonda para detectar translocaciones específicas.

FISH Metafásica

Consiste en la detección de secuencias de ADN directamente sobre cromosomas en metafase, en extensiones citogenéticas. Se utilizan sondas específicas.