PRÁCTICA 9

TIEMPO DE PROTROMBINA

DEFINICIÓN

El tiempo de protrombina es el tiempo que tarda en formarse el coágulo en un plasma citratado en exceso de tromboplastina cálcica. Mide el mecanismo extrínseco de activación de la coagulación.

El tiempo de protrombina (TP) es un procedimiento de detección global con cinco aplicaciones principales:

• Una prueba rápida para detectar deficiencias simples o combinadas del sistema de coagulación extrínseca, indicativas de trastornos congénitos o adquiridos.
• Sirve para evaluar la función hepática.
• Sirve para detectar déficit de vitamina K.
• Prueba de screening preoperatorio para detectar un posible desorden hemostático.
• Una prueba sensible para el control del tratamiento con anticoagulantes orales (acenocumarol, warfarina, dicumarol, etc.); ya que estos, debido a que inhiben la acción de la vitamina K, reducen la producción en el hígado de los factores II, VII, IX, X, PS y PC. Debido a la sensibilidad del TP ante los niveles de los factores II, VII y X, esta prueba se utiliza para controlar a los pacientes con anticoagulantes orales.

MÉTODOS PARA SU DETERMINACIÓN

Se emplea el método de QuicK que puede realizarse en forma manual o semiautomatizada; también existen métodos automatizados.

FUNDAMENTO

Se basa en activar la cascada de la coagulación extrínseca mediante la incubación del plasma con una cantidad óptima de tromboplastina y calcio, y medir el tiempo que tarda en formarse el coágulo.

PROCEDIMIENTO MANUAL

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

• Material para toma de muestra.
• Tubos de ensayo de plástico o vidrio siliconado.
• Micropipeta de 100 y 200 µl.
• Pipeta de 5 ml.
• Aguja o gancho de metal.
• Cronómetro.
• Baño termorregulado a 37°C.
• Centrífuga.
• Tromboplastina cálcica.
• Agua destilada o tridestilada.
• Citrato de sodio al 3,2%.

Reconstitución y conservación del reactivo

El reactivo es una preparación liofilizada de tromboplastina de cerebro de conejo deshidratada en acetona, más calcio, tampón, conservantes y estabilizantes. Se debe reconstituir con la cantidad de agua tridestilada o desionizada indicada en la etiqueta del frasco. Inmediatamente después de la adición del agua, mezclar bien el contenido del frasco antes de su uso para asegurar la completa disolución. Si se deja en reposo, volver a mezclar bien antes de usar para asegurar la homogeneidad. Una vez reconstituido, bien tapado, es estable 5 días a una temperatura entre 2° a 8°C, 24 horas a una temperatura entre 15° a 25°C y 8 horas a 37°C. No congelar.

Son indicios de deterioro del reactivo: la detección de ausencia de vacío al abrir el frasco, dificultad en la reconstitución del reactivo, imposibilidad de obtener valores reproducibles.

MUESTRA

Plasma.

Obtención y conservación de la muestra

• Para evaluar la hemostasia sanguínea, el paciente no necesita estar en ayunas.
• Para pruebas de coagulación, en general, se utiliza nueve partes de muestra más 1 parte de citrato de sodio al 3,2%, para lo cual se puede preparar tubos de plástico o vidrio siliconado con 0,3 ml de citrato de sodio al 3,2%. En el mercado ya vienen tubos al vacío específicos para estas pruebas (tubos tapa celeste).
• Tomar 3 ml de muestra (con jeringa o tubos al vacío) mediante punción venosa, tomando en cuenta todas las recomendaciones de toma de muestra.
• Vaciar 2,7 ml de muestra al tubo que contiene el anticoagulante.
• Mezclar suavemente por cuatro veces y centrifugar a 3.000 rpm durante 15 minutos, para obtener un plasma pobre en plaquetas.
• Separar inmediatamente el plasma del paquete globular (antes de las dos horas) utilizando material de plástico (pipeta y tubo de plástico) o de vidrio siliconado.
• La prueba se debe realizar antes de las 4 horas como máximo desde la toma de muestra y conservado a temperatura ambiente. Caso contrario, congelar a -20°C hasta su procesamiento.
• Las muestras no deben permanecer más de 5 minutos a 37°C.
• La conservación prolongada de la muestra a temperatura ambiente o a 37°C conlleva una inactivación parcial de los factores V y VIII, mientras que la refrigeración prolongada activa al factor VII.
• La toma de muestra se realizará por punción venosa limpia (sin traumas) y no precedida por una estasis prolongada causada por el torniquete (más de 1 min).
• En caso de que el paciente tenga antecedentes de alteración en la coagulación, el personal de toma de muestra debe controlar el sitio de punción durante varios minutos y aplicar un vendaje de compresión antes de despedirlo.

Corrección del volumen de anticoagulante utilizado en casos de hematocritos elevados

Las muestras con hematocritos mayores a 60% (0,60L/L) suelen presentar TP falsamente prolongados, debido a que en pacientes policitémicos, la disminución del volumen plasmático con respecto a la sangre entera eleva de manera inaceptable la relación anticoagulante/plasma, lo que produce tiempos falsamente prolongados en estas pruebas.

Para corregir este error se debe modificar la cantidad de anticoagulante empleando la siguiente fórmula:

Vol. de anticoagulante en ml = Vol. de sangre en ml x (100 – Hto del paciente en %) x 0,00185.

O caso contrario, modificar el volumen de sangre, mediante la siguiente fórmula:

Vol. de sangre en ml = Vol. de sangre en ml x (60/100) – hematocrito.

PROCEDIMIENTO

• Atemperar 100 µl de la muestra y el reactivo colocando ambos en un baño termorregulado a 37°C, por 2 a 3 minutos (no más de 5 minutos).
• Añadir 200 µl del reactivo atemperado al tubo que contiene la muestra e inmediatamente activar el cronómetro.
• Mezclar y a partir de los 6 a 7 segundos, sacar el tubo del baño, inclinar cada segundo y observar la formación del coágulo, para lo cual se puede utilizar un gancho de metal o alambre.
• Una vez que se observa el coágulo, se para el cronómetro y se registra el dato.

RESULTADO

El resultado final es el tiempo que marcó el cronómetro una vez que se formó el coágulo.

INFORME

Se informa en segundos y décimas de segundo.

VALORES DE REFERENCIA

De 11 a 13 segundos. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus valores de referencia.

CONTROL DE CALIDAD

Se debe procesar controles de plasma, tanto normal como patológico, siempre que se inicie un ciclo de pruebas, al cambiar el reactivo y al menos cada 8 horas de cada jornada de análisis. Los controles deben procesarse en las mismas condiciones que se procesan las muestras. Si se obtiene un valor fuera de los rangos establecidos, debe comprobarse el estado de los controles, los reactivos, el agua y el equipo.

ACTIVIDAD PROTROMBÍNICA

Es la relación del valor del TP del paciente con respecto a un TP normal expresada en porcentaje. Esto facilita la interpretación de los resultados, sobre todo por la variación que existe en los valores de referencia entre los diferentes laboratorios. Para calcular el porcentaje de actividad se debe utilizar la curva de calibración realizada previamente en el mismo laboratorio.

Elaboración de la curva de calibración

• Se puede utilizar un plasma control normal o un pool de plasmas con valores normales de TP.
• Para preparar el pool, mezclar en un tubo 1,5 a 2 ml de por lo menos 5 a 6 plasmas frescos.
• Con ayuda de solución salina (solución fisiológica), preparar 10 diluciones de la siguiente manera:

• Determinar el TP, por duplicado, para cada dilución; aplicando el procedimiento anteriormente descrito. La diferencia entre ambos tubos debe ser inferior a 0,5 segundos; caso contrario se deberá repetir la prueba.
• Promediar los tiempos obtenidos para cada par de tubos.
• En un papel milimetrado o logarítmico, graficar los resultados obtenidos en un sistema de coordenadas, colocando los TP en segundos en el eje de las ordenadas y los porcentajes en el eje de las abscisas; obteniéndose una recta o una parábola, respectivamente.
• Dado que no es cómodo trasladar los resultados en segundos de cada muestra problema a la recta de calibración, se recomienda establecer previamente una tabla de correspondencias entre tiempos y actividades.
• Cada laboratorio debe trazar su propia curva de calibración, correspondiente al lote de reactivos en uso. Repetir con cada nuevo lote de reactivos.
• En ningún caso es válido calcular el porcentaje de actividad obteniendo el factor de calibración por regla de tres con el tiempo del testigo normal.

RESULTADO

El resultado se calcula interpolando el valor obtenido del TP en segundos del paciente con la recta o parábola obtenida en la curva de calibración y determinando así el porcentaje.

INFORME

Se informa como actividad protrombínica en porcentaje.

VALORES DE REFERENCIA

80 a 100%.

DETERMINACIÓN DEL INR (COCIENTE INTERNACIONAL NORMALIZADO O RAZÓN NORMALIZADA INTERNACIONAL)

La Organización Mundial de la Salud (OMS) junto con el Comité Internacional de Trombosis y Hemostasia, han recomendado que los informes de los resultados del TP de los pacientes en terapia con anticoagulantes orales incluyan los valores de INR. Los resultados del INR son independientes de los reactivos y métodos utilizados y están preparados específicamente para valorar pacientes estabilizados sometidos a terapia con anticoagulantes orales a largo plazo.

El INR nos permite comparar y estandarizar los resultados procedentes de varios analizadores de tromboplastinas y de coagulación para que sean equivalentes.

El INR se calcula aplicando una fórmula o utilizando la tabla de conversión.

1. Aplicando la fórmula:

INR = Cociente Internacional Normalizado o Razón Normalizada Internacional.

TP del paciente = Valor del tiempo de protrombina en segundos obtenido del paciente.

TP normal = Valor promedio del tiempo de protrombina normal de acuerdo a los valores de referencia empleados.

ISI (Índice de Sensibilidad Internacional) = Cada fabricante atribuye un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) a cada lote de tromboplastina, indicando la sensibilidad relativa de su reactivo con respecto a una tromboplastina de referencia internacional. Por ejemplo, si una tromboplastina tiene la misma sensibilidad que la tromboplastina de referencia, entonces el ISI es 1,0. Un valor de ISI superior a 1,0 indica que la tromboplastina no es tan sensible como la tromboplastina de referencia. Se recomienda el uso de tromboplastina con ISI menor a 1,2. Cada reactivo trae consigo su ISI con el cual se debe realizar los cálculos.

2. Utilizando la tabla de conversión: Primero, calcular el cociente (R) dividiendo el TP del paciente encontrado entre el valor promedio de referencia del TP, luego buscar ese dato encontrado en la primera columna de la tabla que viene adjunta al reactivo e interpolar con el dato de ISI que corresponde al reactivo utilizado; el valor obtenido es el que corresponde al INR del paciente.

VALORES DE REFERENCIA

Los intervalos terapéuticos para INR pueden variar dependiendo de la indicación del tratamiento anticoagulante oral. Sin embargo, valores de 2 a 3 de INR indican una buena terapia.

RECOMENDACIONES

• Se deben seguir estrictamente las instrucciones del fabricante del reactivo utilizado en cuanto al procedimiento, volumen, tiempo y temperatura de incubación.
• Seguir estrictamente las recomendaciones en cuanto a la toma y obtención de muestra.
• Mantener estrictamente el tipo, concentración y cantidad de anticoagulante.
• Se debe realizar la prueba por duplicado; la diferencia de ambos valores no debe ser mayor al 10%; de otro modo, debe repetirse.
• Tener mucho cuidado con la reconstitución del reactivo, utilizar agua tridestilada (puede ser de inyectable) en cantidad indicada en la etiqueta.
• El pH de la reacción debe estar entre 7,2 a 7,4.
• Se recomienda usar un gancho de metal para la verificación de la formación del coágulo, empleando buena iluminación.
• Conservar el reactivo de acuerdo a las instrucciones anteriores.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatología clínica y otras observaciones.

Variables preanalíticas: El uso de anticoagulantes diferentes al citrato (oxalatos, EDTA, heparina, etc.) para la obtención de las muestras o contaminación con estos, puede dar resultados falsamente prolongados. También la condición de la muestra (hemólisis) puede alterar los resultados. La ictericia y la lipemia de la muestra alteran los resultados cuando estos son determinados por métodos ópticos.

Variables por fármacos: Muchos fármacos administrados habitualmente pueden afectar los resultados de TP. Esto debe tomarse en cuenta especialmente cuando se obtienen resultados anormales, inusuales o imprevistos, para lo cual debe realizarse otras pruebas de coagulación para confirmar el origen de la anormalidad. El TP está prolongado en pacientes con tratamiento con antagonistas de la vitamina K. También la hirudina y otros inhibidores de trombina directos, en dosis terapéuticas, pueden prolongar el tiempo de protrombina.

Variables por enfermedad: El TP puede estar prolongado por deficiencia de algún factor vitamina K dependiente (II, VII, IX, X), déficit de vitamina K, sistema hemostático inmaduro en el neonato, presencia de inhibidor de factor V, presencia de anticoagulante lúpico.

También en enfermedades hepáticas, coagulación intravascular diseminada (CID), coagulopatías por consumo, hiperfibrinólisis, afibrinogenemia, hipofibrinogenemia, disfibrinogenemia, deficiencia adquirida o congénita de factor V.

PRÁCTICA 10

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (aPTT)

DEFINICIÓN

El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es el tiempo que tarda en coagular un plasma descalcificado, en presencia de un exceso de cefalina, activador y calcio. La velocidad de formación del coágulo depende de la concentración de todos los factores de la vía intrínseca, siempre que no existan inhibidores de la reacción. Se considera una prueba mucho más sensible y específica que el tiempo de coagulación.

La tromboplastina parcial (o cefalina) debe su nombre a que procede de la tromboplastina tras la eliminación del factor histico, conteniendo solo una mezcla de fosfolípidos y un activador de contacto con elevada carga eléctrica negativa.

El aPTT es una prueba sensible a la deficiencia de ciertos agentes procoagulantes (valoración global de la vía intrínseca) y anticoagulantes del plasma. Sus principales aplicaciones son:

• Sirve para detectar anormalidades en la vía intrínseca de la coagulación, como son los factores necesarios para la formación del activador intrínseco de la protrombina, es decir, los factores VIII, IX, XI y XII.
• También detecta deficiencias severas de los factores II, V, X y fibrinógeno. No detecta los trastornos plaquetarios, las deficiencias de los factores VII y XIII, ni los problemas vasculares.
• Prueba de screening preoperatorio para detectar un posible desorden hemostático.
• Una prueba sensible para el control de la terapéutica anticoagulante por heparina.
• Permite la identificación rápida de hemofílicos en potencia, a fin de poder someterlos a tratamientos preventivos prequirúrgicos y evitar problemas hemorrágicos.

MÉTODOS PARA SU DETERMINACIÓN

Existen métodos manuales, semiautomatizados y automatizados.

MÉTODO MANUAL

FUNDAMENTO

Se basa en activar la vía intrínseca de la coagulación mediante la incubación del plasma descalcificado con tromboplastina parcial (cefalina), activador y calcio, y medir el tiempo que tarda en formarse el coágulo.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

• Material para toma de muestra.
• Tubos de ensayo de plástico o vidrio siliconado.
• Micropipeta de 100 µl.
• Pipeta de 5 ml.
• Aguja o gancho de metal.
• Cronómetro.
• Baño termorregulado a 37°C.
• Centrífuga.
• Tromboplastina parcial: contiene cefalina de cerebro con ácido elágico como activador soluble u otro activador (depende de la marca del reactivo).
• Cloruro de calcio al 0,025 mol/L.
• Agua tridestilada (en caso de que el reactivo venga liofilizado).
• Citrato de sodio al 3,2% (109 mmol/l).

Reconstitución y conservación del reactivo

En caso de que el reactivo se encuentre liofilizado, se debe reconstituir con la cantidad de agua tridestilada o desionizada indicada en la etiqueta del frasco. Inmediatamente después de la adición del agua, mezclar bien el contenido del frasco antes de su uso para asegurar la completa disolución. Si se deja en reposo, volver a mezclar bien antes de usar para asegurar la homogeneidad. Una vez reconstituido, bien tapado, es estable, 14 días refrigerado entre 2° a 8°C. Los reactivos que vienen reconstituidos (como el APTTest elágico) son estables hasta la fecha indicada en la caja del reactivo.

Son indicios de deterioro del reactivo: la detección de ausencia de vacío al abrir el frasco, dificultad en la reconstitución del reactivo, imposibilidad de obtener valores reproducibles.

MUESTRA

Plasma.

Obtención de la muestra

Se deben tener en cuenta las mismas recomendaciones que la muestra obtenida para el tiempo de protrombina.

PROCEDIMIENTO

• En un tubo de plástico, incubar 100 µl de la muestra con 100 µl del reactivo de aPTT, colocando en un baño termorregulado a 37°C, por 2 a 3 minutos (no más de 5 minutos).
• Añadir 100 µl de cloruro de calcio (también atemperado) e inmediatamente activar el cronómetro.
• Mezclar y mantener el tubo en el baño unos 25 segundos.
• Sacar el tubo del baño, inclinar cada segundo y observar la formación del coágulo, para lo cual se puede utilizar un gancho de metal o alambre.
• Una vez que se observa el coágulo, se para el cronómetro y se registra el dato.

RESULTADO

El resultado final es el tiempo que marca el cronómetro una vez que se forma el coágulo.

INFORME

Se informa en segundos y décimas de segundo. También se puede informar en %, relacionando el tiempo en segundos encontrado del paciente con el aPTT de un plasma control (100%).

VALORES DE REFERENCIA

De 33 a 48 segundos. Se recomienda que los valores de referencia deben ser obtenidos para la población usuaria de cada laboratorio, además que varían de acuerdo al fabricante del reactivo.

RECOMENDACIONES

• Se deben seguir estrictamente las instrucciones del fabricante del reactivo utilizado en cuanto al procedimiento, volumen, tiempo y temperatura de incubación.
• Tener en cuenta todas las recomendaciones necesarias para la toma y obtención de muestra.
• Tener cuidado con las proporciones de muestra/anticoagulante.
• Respetar la concentración del anticoagulante (citrato al 3,2%).
• Evitar la contaminación con heparina.
• Exigir un lavado prolijo del material.
• Tener cuidado con los tiempos de incubación, pH de la reacción (7,2 a 7,4) y la temperatura.
• Tener mucho cuidado con la reconstitución del reactivo, utilizar agua tridestilada (puede ser la utilizada para inyectable) en cantidad indicada en la etiqueta (en caso de que el reactivo venga liofilizado).
• Conservar el reactivo de acuerdo a las instrucciones anteriores.
• Se debe realizar la prueba por duplicado; la diferencia de ambos valores no debe ser mayor al 10%; de otro modo, debe repetirse.
• Se recomienda usar un gancho de metal para la verificación de la formación del coágulo, empleando buena iluminación.

CONTROL DE CALIDAD

Existen plasmas control para este propósito (normales y patológicos); también puede emplearse alícuotas de un pool de plasmas normales (congelar a -20°C).

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA HEPARINA

Este método es útil como control de la respuesta a la heparina en pacientes tratados con este anticoagulante.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar una solución de trabajo de heparina con solución fisiológica cuya concentración sea 10 Unidades/ml. Debe emplearse la misma heparina que se suministra al paciente.
2. Preparar diluciones con esta solución de trabajo utilizando como diluyente un pool de plasmas frescos con aPTT normal o plasma control normal. Se deberán obtener diluciones de: 0,8; 0,6; 0,4; 0,2 y 0,1 Unidades/ml.
3. Determinar el aPTT para cada dilución y graficar en papel semilogarítmico tomando en cuenta el aPTT en segundos vs. concentración de heparina.
4. El valor obtenido para el paciente heparinizado debe correlacionarse con los valores de la gráfica, para obtener la concentración actual de heparina circulante.
5. En caso de que solicite el médico, reportar en Unidades/ml.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica del paciente, la sintomatología clínica y otras observaciones.

Variables preanalíticas: El uso de anticoagulantes diferentes al citrato (oxalatos, EDTA, heparina, etc.) para la obtención de la muestra o contaminación con estos, puede dar resultados falsamente prolongados. También la condición de la muestra (hemólisis) puede alterar los resultados. La ictericia y la lipemia de la muestra alteran los resultados cuando estos son determinados por métodos ópticos (coagulómetros).

Variables por enfermedad: El aPTT puede estar prolongado por deficiencia congénita o adquirida de algún factor relacionado con la vía intrínseca de la coagulación (factor VIII, IX, XI y XII), por lo que se considera un método rápido de diagnóstico para detectar pacientes con hemofilias (hemofilia A, B, C), antes de realizar pruebas confirmatorias. Pacientes con anticoagulante lúpico, anticuerpos anti – factor VIII.

También en casos de d déficit severas del factor I (afibrinogenemia, hipofibrinogenemia, disfibrinogenemia), II, V y X.

Por último, en casos de pacientes heparinizados.