Conceptos Básicos

La microbiología industrial se encarga de cultivar microorganismos a gran escala. Su objetivo es realizar transformaciones químicas o producir bienes comerciales. Gracias a la biotecnología y la manipulación genética, sus aplicaciones se han ampliado.

En la industria alimentaria se usa para producir alimentos mediante fermentación. Alimentos como el vino, la cerveza, el queso y el yogur son ejemplos comunes. En agricultura y ganadería, permite mejorar especies y crear organismos modificados genéticamente. Estas mejoras han sido parte de la historia humana desde hace más de 10.000 años.

En medicina, facilita la producción masiva de fármacos; además, se crean modelos animales o celulares para estudiar enfermedades e incluso se investiga para generar órganos para trasplantes.

En el medio ambiente, se aplica en la biorremediación y productos biodegradables. También contribuye a la conservación de especies en peligro de extinción.

La industria alimentaria es una de las que más invierte en biotecnología; los microorganismos más usados son las levaduras y bacterias. Las fermentaciones pueden ser alcohólicas (vino, pan) o lácticas (yogur, queso).

Microorganismos en la Biotecnología

Fabricación del Pan

La elaboración del pan se hace partiendo de harinas elaboradas a base de cereales (harinas panificables), sal y agua, a las que se añaden levaduras que crecen de manera espontánea en los cereales (Saccharomyces cerevisiae). Estas levaduras fermentan los azúcares formando etanol y CO2 (gas), provocando que la masa aumente su tamaño y que se forme la estructura suave y esponjosa de la miga (lo que se denomina subida o levado del pan). El etanol generado se evapora durante el proceso de horneado.

Fabricación del Yogur

Intervienen distintos tipos de bacterias, entre las que destacan los géneros Lactobacillus y Streptococcus. Estas bacterias utilizan como fuente de energía la lactosa presente en la leche de diversos mamíferos y liberan ácido láctico. Además de darle el sabor particular, provoca un incremento de la acidez, de modo que las proteínas de la leche precipitan, confiriéndole un aspecto semilíquido al yogur.

Ingeniería Genética

La biotecnología es una técnica multidisciplinar, que se usa hace miles de años, en la que se utilizan organismos vivos, sus componentes moleculares o sus funciones biológicas para obtener un producto (alimenticio, farmacéutico, etc.) o un servicio (depuración de aguas, terapias, etc.) que sean útiles para la humanidad.

Una de las ramas de esta biotecnología es:

La ingeniería genética es la modificación de los genes de una célula, un conjunto de ellas o un organismo, mediante inserción o eliminación de material genético en su genoma, utilizando diferentes tecnologías de edición genética.

Se denomina organismo modificado genéticamente (OMG) al “Organismo cuyo material genético es manipulado o alterado deliberadamente con el fin de otorgarle alguna característica específica”. Los OMG presentan un gen que los investigadores han “dormido” para que no realice su función, otros tienen genes que rinden más que cualquier trabajador en su jornada más productiva, y a otros se les ha añadido un extra que nunca imaginaban que tendrían.

Los organismos transgénicos son aquellos a los que se ha insertado algún gen, conocido como transgén, procedente de otro organismo.

Aplicaciones de la Ingeniería Genética en la Producción Animal

La ingeniería genética permite modificar genéticamente animales, con diferentes aplicaciones, desde el mejoramiento de las razas domésticas hasta el empleo de los animales como fábricas de fármacos.

La modificación genética se realiza de dos maneras:

Anulando o alterando ciertos genes presentes en un animal (OMG) de manera que esta modificación se transmita a la descendencia, o bien transfiriendo genes a un animal desde la misma especie o de una especie diferente (transgénico).

Ejemplos:

• Existen en la actualidad cabras transgénicas que generan una proteína anticoagulante en sus ubres; este producto es el primer medicamento producido en animales transgénicos.
• Se han creado bovinos transgénicos capaces de producir hormona de crecimiento humana en la leche y de perpetuar esta capacidad en la descendencia.
• Obtención de insulina humana a partir de la leche.

Terapia Génica

La terapia génica es una técnica utilizada para tratar, prevenir o curar enfermedades mediante el uso de uno o más genes. Su funcionamiento habitual consiste en añadir copias nuevas de un gen dañado o en reemplazar un gen defectuoso o ausente por una versión sana. En seres humanos, esta transferencia genética se realiza exclusivamente en células somáticas, es decir, en todas las células del cuerpo excepto los gametos.

Modificar las células germinales es un tema controvertido, ya que cualquier cambio sería hereditario y afectaría a los descendientes, lo que plantea serias implicaciones éticas. La transferencia de genes puede llevarse a cabo de dos formas: ex vivo o in vivo. En el método ex vivo, las células se extraen del paciente, se modifican en el laboratorio y luego se reintroducen en el cuerpo. El método in vivo consiste en introducir los genes directamente en las células del paciente.

La terapia génica se ha empleado en el tratamiento de enfermedades hereditarias como la hemofilia y la anemia de células falciformes. También ha mostrado resultados en el tratamiento de enfermedades adquiridas, como algunos tipos de leucemia. Esta técnica representa un gran avance en la medicina actual.

El ADN Recombinante

El ADN recombinante (ADNr) es una molécula resultante de la unión artificial de dos fragmentos de ADN. Así, la tecnología de ADN recombinante consiste en un conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. Cuando se introduce un ADN recombinado en algún organismo, ocurre una modificación genética que se traduce en un cambio de rasgos ya existentes o en la expresión de rasgos nuevos.

Construcción de un ADN Recombinante

La producción de ADN recombinante se realiza en cinco etapas:

1. Elección y aislamiento de un fragmento de ADN que se quiera transferir. Se realiza a través de técnicas de hibridación de ADN, mediante sondas de ADN marcadas complementarias al gen objeto de búsqueda. Para ello es preciso previamente conocer parte de la secuencia del gen que se está rastreando. A veces estos genes se obtienen de bibliotecas genómicas.
2. Amplificación del ADN seleccionado, a través de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que permite sintetizar una cantidad suficiente de ADN a partir de una sola molécula para su posterior manipulación.
3. Corte específico del ADN: el ADN se corta en fragmentos pequeños (secuencias específicas de nucleótidos) mediante endonucleasas o enzimas de restricción (“tijeras moleculares”). Los extremos libres se denominan bordes pegajosos o cohesivos, ya que pueden unirse a otros fragmentos de ADN cortados por la misma enzima.
4. Inserción de los fragmentos de ADN: se emplean vectores de clonación, que son pequeñas moléculas de ADN que pueden autorreplicarse dentro de células hospedadoras e integrarse en su genoma y, además, contienen marcadores de selección, generalmente genes de resistencia a un antibiótico, que permiten seleccionar las células que lo han incorporado al ser tratadas con el antibiótico. Los más usados son los plásmidos y los virus.
5. Propagación del cultivo. Detección y selección de clones recombinantes.

Aplicaciones del ADN Recombinante

El ADN recombinante tiene aplicación en varios campos como en la industria farmacéutica, la industria alimentaria, la industria agrícola o en la investigación biosanitaria, entre otros.

Industria Farmacéutica

Síntesis de antibióticos, hormonas (insulina, hormona de crecimiento), vacunas, factores de coagulación de la sangre (para el tratamiento de la hemofilia) o interferón. Para ello se utilizan microorganismos recombinantes: mediante ingeniería genética, se implanta el gen humano responsable de la síntesis de una sustancia (como la insulina) en el ADN de un organismo (que será entonces un OGM de tipo transgénico), de forma que el clon de células resultantes fabrique esa sustancia. Si el gen humano se implanta en un cigoto, este cigoto recombinante hará que el animal modificado genéticamente produzca la sustancia de interés, como las terneras clónicas que producen anticuerpos o factores de coagulación.

Finalmente, otro ejemplo de la aplicación de la ingeniería genética es la síntesis de nuevos antibióticos.

Industria Agrícola

En el campo de la agricultura, la aplicación del ADN recombinante ha permitido obtener plantas transformadas más productivas, resistentes a herbicidas o a los virus que destruyen los cultivos, y a sobrevivir a condiciones climáticas extremas o con mayor producción de vitaminas (ejemplo del arroz). A estos productos se les llaman organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos.

• TOMATES: se obtuvieron tomates que maduran más lentamente, permitiendo más días para su transporte, anulando el gen que regula su maduración al haberlo insertado en sentido inverso.
• TRIGO: Se obtiene trigo más resistente a las plagas y a los herbicidas por incorporar a su ADN genes de bacterias o insectos.
• MAÍZ: Se obtiene maíz que resiste a las heladas al incorporar a su ADN un gen de un pez resistente al frío. También se ha obtenido maíz que resiste a determinadas plagas por haber incorporado un gen del trigo. Hay maíz que resiste a herbicidas por haberle incorporado un gen de bacterias.

Medio Ambiente

Utilización de OGM para la biorremediación (recuperación de suelos contaminados por metales pesados, obtención de energía mediante la depuración de aguas residuales, degradación de residuos tóxicos, obtención de plásticos biodegradables). Esta técnica empleada para contrarrestar los efectos de los contaminantes en el medio se denominó biorremediación.

La biorremediación es un proceso que utiliza microorganismos y plantas (fitorremediación) para mejorar el medio ambiente al degradar compuestos tóxicos. Los microorganismos poseen un metabolismo específico que les permite descomponer sustancias nocivas, reduciendo su impacto negativo en el entorno. Una variante es la degradación enzimática, que implica el uso de enzimas producidas comercialmente por bacterias (naturales o modificadas genéticamente) capaces de descomponer sustancias dañinas. Un ejemplo son las cianobacterias modificadas con genes de Pseudomonas sp., que pueden degradar diversos hidrocarburos.

Industria Alimentaria

Actualmente, cada vez más se encuentran en el mercado alimentos desarrollados a partir de organismos genéticamente alterados. En el campo de la industria alimentaria, la tecnología del ADN recombinante ha logrado reducir costes, aumentar la producción y diseñar nuevos productos.

Investigación Biosanitaria

La tecnología del ADN recombinante es ampliamente utilizada en el ámbito de la investigación biomédica. En este sentido, la ingeniería genética ha permitido identificar genes implicados en muchas enfermedades, lo que ha permitido su detección y tratamiento. Para dar algunos ejemplos, el ADN recombinante se ha utilizado como técnica diagnóstica en el virus del VIH. Actualmente, se está investigando también con esta tecnología para el tratamiento del cáncer.

Clonación Molecular

La clonación del ADN es el proceso por el cual se generan múltiples copias de ADN, ya sean fragmentos de interés o genes completos. Dicho proceso puede realizarse in vivo o in vitro.

• In vivo: Consiste en transferir el fragmento de ADN o gen a una célula hospedadora mediante un vector.
• In vitro: Consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un procedimiento biotecnológico que se lleva a cabo en el laboratorio.

La clonación del ADN in vivo consiste en unir el ADN que se desea clonar con el ADN de un vector mediante enzimas (endonucleasas de restricción y ligasas), convirtiéndose en un ADN recombinante. Ese vector de clonación es capaz de entrar en una célula hospedadora, transportando ese ADN, y replicándose en ella de forma independiente.

Se necesitan dos elementos:

• Un vector de clonación: Los vectores son moléculas de ADN a las que se les pueden insertar otros fragmentos de ADN. Pueden utilizarse vectores virales como el fago λ, aunque los más usados son los plásmidos, que son pequeñas moléculas circulares de ADN que pueden replicarse independientemente (es decir, sin asociarse al ADN cromosómico) en bacterias.
• Un hospedador: generalmente bacterias o levaduras.

Proceso de Clonación

El proceso de clonación de un gen en una bacteria sigue estos pasos:

1. Aislamiento del fragmento de ADN mediante enzimas de restricción. Se realiza un lisado (ruptura) de las células que contienen el gen de interés y se extrae el ADN. Se aísla la porción de ADN en la que está el gen y se corta la cadena de ADN en puntos específicos, llamados sitios de restricción, mediante este tipo de endonucleasas.
2. Formación del ADN recombinante. El ADN aislado se inserta en un plásmido utilizando la misma enzima de restricción para cortar ambos, el plásmido y el ADN de interés, en un sitio específico. Esto asegura que los extremos resultantes sean complementarios (extremos cohesivos). Luego, se agrega ADN ligasa, que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre los extremos 5′ y 3′ de los fragmentos de ADN, uniendo el plásmido con el ADN de interés. El plásmido recombinante resultante debe contener un gen marcador, como genes de resistencia a antibióticos, genes de fluorescencia o marcadores enzimáticos, lo que facilita la selección de las células que contienen el plásmido recombinante.
3. Transformación de las bacterias. Consiste en la incorporación de los plásmidos recombinantes a las células hospedadoras, normalmente bacterias, como E. coli. Se trata de un procedimiento largo, en el que se somete a las bacterias a un choque térmico, para garantizar que las células hospedadoras adquieran el ADN recombinante y sean capaces de reproducirse y crear colonias que contengan este ADN deseado.
4. Selección y cultivo de las bacterias transformadas. El plásmido recombinante contiene un gen marcador, como la resistencia a la ampicilina, que permite seleccionar las bacterias transformadas. Al colocar las células en una placa de Petri con agar y ampicilina, solo las bacterias que contienen el gen de resistencia crecerán, lo que confirma que la transformación fue exitosa. A medida que las bacterias se duplican, también lo hacen los plásmidos recombinantes y el gen insertado, lo que resulta en una clonación natural.
5. Aislamiento de los plásmidos recombinantes y/o de las copias del gen de interés. Finalmente, obtendremos millones de copias de ese plásmido recombinante que pueden aislarse mediante lisis de las bacterias y precipitación mediante centrifugación diferencial.

La clonación de ADN es una técnica común en biología molecular con diversas aplicaciones. Los plásmidos recombinantes pueden usarse en terapias génicas, como en la fibrosis quística, para suministrar una copia normal del gen y ralentizar el deterioro pulmonar. También se puede lograr que bacterias recombinantes produzcan proteínas de interés, como la insulina humana o la hormona del crecimiento, al transcribir y traducir el gen insertado.

PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa

La PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa es una técnica que permite obtener un alto número de copias de un fragmento de ADN. Con este método podemos conseguir muchas copias de un gen si conocemos las secuencias de nucleótidos que lo flanquean. La PCR imita el proceso de replicación del ADN in vitro, sin el uso de células, y lo repite varias veces, en un aparato especial llamado Termociclador.

Componentes de la PCR

Para llevar a cabo la PCR se necesitan los siguientes componentes:

• El ADN que se quiere amplificar.
• Una ADN polimerasa resistente al calor (Taq polimerasa), que funciona a temperaturas elevadas (95°C).
• Cebadores específicos para el fragmento de ADN. Estos cebadores o primers son oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ADN que flanquean el fragmento o gen a amplificar, y proporcionan a la ADN polimerasa un extremo 3’ libre donde comenzar.
• Una mezcla en disolución con los cuatro tipos de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) necesarios para la síntesis de ADN nuevo.

Ciclo de Replicación de la PCR

Cada ciclo de replicación tiene tres etapas:

1. Etapa 1: Desnaturalización de ADN. Calentamiento a 95°C para separar las dos cadenas de ADN que se va a amplificar.
2. Etapa 2: Hibridación de los cebadores. La temperatura baja a 55°C para facilitar que los cebadores hibriden con sus secuencias complementarias en cada una de las dos cadenas de ADN.
3. Etapa 3: Síntesis de ADN. Aumento de la temperatura a 72°C para que la ADN polimerasa sintetice las nuevas cadenas de ADN.

Finalizado un ciclo de replicación, se vuelve de nuevo a la etapa 1, en la que vuelve a aumentar la temperatura para que se separen las dos cadenas dobles de ADN que acaban de formarse, repitiéndose el ciclo de nuevo.

Cada ciclo de replicación del ADN tarda unos minutos y duplica el número de moléculas, produciendo una amplificación exponencial. Es por ello que, si partimos de una única molécula de ADN, tras 30 ciclos se obtienen dos billones de copias del fragmento en menos de 90 minutos.

Técnicas que utilizan PCR

En la actualidad, la PCR se utiliza en técnicas tales como:

• Estudios de expresión de genes: A partir de moléculas de ARN aisladas de una célula, se obtiene su correspondiente ADN mediante Transcripción Inversa o Retrotranscripción (RT) y después se realiza la amplificación con cebadores específicos. Todo ello se realiza en un único proceso llamado RT-PCR. Mediante esta prueba se puede determinar si en las células de las que se ha extraído el ARN se está expresando su gen.
• Detección de infección activa de virus, como Ébola o COVID. En el caso de COVID, al ser un virus con ARN, se realiza la RT-PCR con cebadores específicos del ADN viral y sondas fluorescentes específicas del virus. Cuanta más fluorescencia se observe en cada ciclo, mayor será la cantidad de material vírico presente inicialmente en el paciente. Para estas pruebas, se usa un termociclador especial que cuantifica la cantidad de fluorescencia detectada.
• Secuenciación automática de un fragmento de ADN añadiendo desoxinucleótidos y didesoxinucleótidos sintéticos (ddNTP) marcados con una sustancia que emite fluorescencia (fluorocromo).

Los ddNTP carecen de OH en el Carbono 3 de la desoxirribosa, por lo que no puede enlazar con el siguiente desoxinucleótido, y la elongación de la cadena se interrumpe.

La PCR se realiza en cuatro tubos diferentes con el fragmento de ADN a secuenciar, la proteína Taq polimerasa, el cebador de dicho fragmento, grandes cantidades de todos los dNTP y cada tubo con un ddNTP de un tipo.

Tras la PCR, el contenido de cada tubo se carga en un pocillo de un gel de electroforesis. Los fragmentos de ADN migran en función de su tamaño (medido en pares de bases), formándose distintas bandas (los fragmentos más pequeños migran más), que se podrán observar gracias a la fluorescencia del ddNTP incorporado. El fragmento de ADN se puede secuenciar según la disposición y orden de las bandas.

Tecnología CRISPR-Cas9

Fundamento

El genoma de bacterias y arqueas presenta unas secuencias especiales llamadas CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), que son repetidas, cortas, palindrómicas y se agrupan en series. Estas secuencias están separadas p