El Código Genético

La clave para traducir el ADN a aminoácidos de proteínas.

El Código Genético: Definición y Características

Correspondencia entre el lenguaje de nucleótidos presente en los ácidos nucleicos y el lenguaje de aminoácidos presente en las proteínas.

Características:

• Código genético escrito de manera lineal usando como letras las bases nitrogenadas que componen el ARNm.
• Cada triplete o codón especifica un aminoácido o una señal de parada (STOP). Hay 4³ = 64 posibles codones.
• El código es degenerado (un mismo aminoácido es codificado por varios codones a la vez).
• El código contiene señales de inicio (AUG) y de fin (UAA, UAG, UGA).
• El código no utiliza ninguna puntuación interna. Los tripletes se leen por orden y sin interrupción (fase de lectura).
• El código no es solapado, los codones no se solapan entre sí.
• El código genético es universal (excepciones: mitocondrias de algunas procariotas).

Experimentos para el Desciframiento del Código Genético

Se buscó determinar qué codones codifican para aminoácidos, señales de STOP y de INICIO.

Aislamiento de la Polinucleótido Fosforilasa

Grunberg-Manago y Ochoa aislaron la enzima polinucleótido fosforilasa, que sintetiza ácido ribonucleico sin necesidad de un molde de ADN. Esta enzima fue clave para técnicas de síntesis de ARNm a partir de ribonucleótidos.

Técnica con Homopolímeros

(Nirenberg y Matthaei) Permitió identificar el aminoácido sintetizado por un homopolímero. Se introducen 20 aminoácidos (uno marcado radiactivamente) y el homopolímero sintetizado (por ejemplo, poli-U). Se succiona la proteína precipitada. Se detectó radiactividad solo en el tubo con el marcador radiactivo para la fenilalanina (Phe) para el homopolímero poli-U, y se dedujo que el codón UUU codificaba para la fenilalanina. Este fue el primer codón identificado. Cambiando la composición del homopolímero se observó: AAA = Lys; CCC = Pro. El codón GGG fue difícil de traducir porque forma estructuras secundarias en el ARN, además de codificar para glicina (Gly).

Técnica de Heteropolímeros de ARN

Se logró descifrar la composición de las bases para diferentes aminoácidos, pero no el orden de las bases. Se incubó polinucleótido fosforilasa con 2 nucleótidos de ARN en diferente proporción para calcular la probabilidad de que se incorpore un nucleótido u otro en un determinado codón y así, calcular la probabilidad de tener una determinada proporción de bases con todas las posibles combinaciones. Al traducir el heteropolímero A-C se obtenía una proteína con distintos porcentajes de los aminoácidos. Se compararon con los porcentajes obtenidos previamente y se determinó qué codones codificaban para los aminoácidos con mayor probabilidad.

Técnica de Unión al Triplete

Se empleó aminoacil-ARNt (aa-ARNt) para que se uniera al ARNm, formando el complejo ARNm-ribosoma-aminoacil-ARNt. Se utilizó marcaje con C14 en el aminoácido que se unía en las cadenas polipeptídicas. Aquí sí se conocía la secuencia de los codones debido a que los ARNm se habían sintetizado por reacciones químicas y no enzimáticas como antes.

Técnica de Copolímeros Repetidos

(Khorana y colaboradores) Se basó en la Hipótesis del Tambaleo (el código genético es degenerado) para asignar aminoácidos a los codones que aún permanecían por identificar. Se usaron copolímeros repetidos en 3 ensayos (UC, UUC, UCUA) y en cada ensayo se corría el marco de lectura. En los 3 ensayos había un codón común que codificaba para el mismo aminoácido, o dos codones para el mismo aminoácido.

Tabla del Código Genético

Permite consultar para qué aminoácido codifica un codón determinado. La degeneración no es uniforme; hay 2 aminoácidos que codifican para un solo codón: triptófano (Trp) y metionina (Met, AUG).

Marcos de Lectura e Hipótesis del Tambaleo

Un ARNm puede traducirse en 3 formas diferentes:

1. Según el punto de inicio desde donde el ribosoma empiece a leer, lo que define los marcos de lectura. Esto cambia por completo los tripletes que se van a leer.
2. Los aminoácidos codificados por varios codones suelen tener las 2 primeras bases iguales; el último nucleótido del codón no es tan específico. Esta es la hipótesis del tambaleo (Francis Crick). Existen 31 tipos de ARNt en bacterias y 48 en animales-vegetales.
3. El codón y el anticodón son antiparalelos y complementarios entre sí.

Excepciones del Código Genético “Universal”

1. Alteraciones: El código genético del núcleo y el de las mitocondrias puede diferir, por ello no es igual en todos los organismos o incluso en la misma célula. Ejemplo: UAG no es señal de STOP ya que codifica para arginina (Arg) en determinadas bacterias. Por tanto, las otras dos opciones de codones (AGA, AGG) sí codificarían la señal de STOP.
2. Presencia de genes solapados: La diferencia de puntos de iniciación provoca genes solapados debido a que, en un gen determinado, ambas cadenas pueden ser codificantes en al menos una región, dando distintos productos de transcripción. El solapamiento que produce corrimiento de la pauta de lectura supone la aparición en el ARNm de codones de parada, que da lugar a distintas cadenas polipeptídicas en su traducción.

La Traducción

Ribosomas

En procariotas, la traducción y transcripción son simultáneas (en eucariotas no).

• Subunidad menor: Unión al ARNm.
• Subunidad mayor: Contiene ARNr y proteínas.
• Sitio A: Entrada del aminoacil-ARNt al ribosoma.
• Sitio P: Formación de enlaces peptídicos entre aminoácidos para formar las proteínas.
• Sitio E: Salida del ARNt liberado del aminoácido que transportaba.

Ribosomas de Procariotas (70S)

• Subunidad menor (30S): Formada por ARNr 16S + 21 proteínas. Contiene la Secuencia Shine-Dalgarno, que permite la unión al ARNm.
• Subunidad mayor (50S): Formada por ARNr 23S y 5S + 31 proteínas.

Ribosomas de Eucariotas (80S)

• Subunidad menor (40S): Contiene ARNr 18S + 33 proteínas. Reconoce la caperuza del ARNm en el extremo 5’ para el inicio de la traducción.
• Subunidad mayor (60S): Contiene ARNr 28S, 5.8S y 5S (este último no en tándem) + 49 proteínas.

Diferencias Génicas entre Procariotas y Eucariotas

Existen diferencias en los genes y en el número de copias de genes para ARNr. Hay muchas copias de genes ribosomales en el genoma de eucariotas porque se deben formar muchos ribosomas.

Genes Ribosomales en Procariotas

Maduración del ARNr 30S para traducción: metilación de bases y pentosas + lisis por endonucleasas (eliminación de intrones). ARNr maduro: 16S, 23S, 5S + ARNt.

Genes Ribosomales en Eucariotas

La maduración no es simultánea a la transcripción. El ARNm inmaduro está dispuesto en tándem (menos el ARNr 5S, que no está con los otros).

• IGS: Separador intergénico.
• ETS: Separador transcrito externo. Secuencia codificante para ARNr 18S.
• ITS: 2 espaciadores transcritos internos que delimitan con el exón que codifica para ARNr 28S y 5.8S.
• ETS: En el extremo 3’.
• IGS: Final del gen.

Este es el transcrito primario que necesita una maduración: modificaciones postranscripcionales (metilación) + lisis de secuencias no codificantes (intrones) por los espliceosomas.

ARN Transferente (ARNt)

Estructura del ARNt

Molécula de ARN simple con apareamientos intracatenarios (zonas de estructura secundaria + tallo-lazo) que le confieren una estructura tridimensional compleja.

• Brazo aceptor: Extremo 5’ (guanina). El aminoácido se une por su grupo carboxilo en el extremo 3’ con secuencia 5’CCA3’.
• Brazo D: (Rico en dihidrouridina) Lugar de reconocimiento por la aminoacil-ARNt sintetasa, enzima que cataliza la unión al aminoácido.
• Brazo anticodón: Complementario y antiparalelo al codón del ARNm.
• Brazo T: Reconocimiento del ribosoma (ribotimidina del uracilo por metilación en posición 5). Las bases modificadas del ARNt ocurren después de su transcripción.

Procesamiento Enzimático Postranscripcional de los ARNt (Trimming)

Los genes de ARNt son policistrónicos: codifican para varios tipos de ARNt al mismo tiempo. El ARNt precursor tiene que sufrir un Trimming: hidrólisis en ambos extremos. Endonucleasas eliminan secuencias intrónicas, formando el brazo anticodón. Ocurre modificación de bases + adición de la secuencia CCA al extremo 3’.

Activación del Aminoácido: Unión al ARNt

Ocurre en el citosol, catalizada por la enzima aminoacil-ARNt sintetasa. Esta enzima cataliza la unión del aminoácido por su extremo carboxilo al extremo 3’ de la secuencia 5’CCA3’ del brazo aceptor, con gasto de ATP. Se forma un enlace éster. Los aminoácidos se activan para la síntesis proteica. La especificidad del ARNt y su aminoácido viene dada por los 20 diferentes tipos de enzima aminoacil-ARNt sintetasa: una por cada aminoácido. Los ARNt que unen el mismo aminoácido son isoaceptores.

Acción de la Aminoacil-ARNt Sintetasa

1. Unión aminoácido-ATP -> aminoácido-AMP.
2. Unión por enlace éster al ARNt, liberando AMP.

Fases de la Traducción

Las subunidades ribosomales se unen para formar el ribosoma solo cuando va a haber traducción.

Elementos Necesarios:

• Ribosomas
• ARNm
• ARNt-aminoácido
• Factores de iniciación (IF-1, IF-2, IF-3)
• GTP

Fase de Iniciación en Procariotas

El ARNm se une a la subunidad pequeña del ribosoma (el ARNr 16S reconoce la secuencia Shine-Dalgarno del ARNm). IF-1 e IF-3 unidos a la subunidad pequeña (30S) impiden la unión de la subunidad grande. IF-2 con GTP permiten la unión del ARNt iniciador con metionina (3’UAG5’) [en bacterias es N-formil-Met] -> formación del complejo iniciador 30S. La hidrólisis de GTP a GDP + Pi produce la liberación de IF-1, IF-2, IF-3, permitiendo la unión de la subunidad mayor (50S) formando el complejo de iniciación 70S.

Fase de Iniciación en Eucariotas

La subunidad pequeña (40S) se une al ARNm porque reconoce la caperuza 5’ (la secuencia Kozak favorece). Se unen proteínas estabilizadoras a la cola poli-A del ARNm 3’ + otras proteínas a la caperuza del extremo 5’. Estas interaccionan entre sí produciendo una torsión del ARNm para que el ribosoma se coloque. Intervienen muchos factores de iniciación que mantienen separadas las subunidades hasta que se liberan.

Fase de Elongación

El ARNt iniciador entra directamente al sitio P del ribosoma. Factores de elongación (EF-Tu, EF-Ts y EF-G) intervienen en la unión con el aminoacil-ARNt. El aminoacil-ARNt + EF-Tu + GTP entra al sitio A. La hidrólisis de GTP libera EF-Tu, que es regenerado por EF-Ts (=GEF) que intercambia GDP por GTP. Cuando los sitios A y P están ocupados por aminoacil-ARNt, se forman enlaces peptídicos catalizados por el ARNr 28S en eucariotas (23S en procariotas). El dipéptido está en el sitio A. Ocurre la translocación en el ribosoma, pasando el dipéptido al sitio P y el ARNt iniciador al sitio E (gracias a EF-G que hidroliza GTP para dar energía). El sitio A vuelve a estar vacío y se repite el proceso.

Fase de Terminación en Procariotas

Se alcanza un codón de STOP (UAA, UAG, UGA) que no entra al sitio A porque no tienen el anticodón complementario. Se sintetizan factores de liberación (RF-1 y RF-2) que reconocen los codones STOP del ARNm. RF-3 rompe la unión del ribosoma al ARNm y el ARNt pasa al sitio E del ribosoma.

La hidrólisis de GTP por RF-3 produce el desensamblaje del ribosoma (separación de subunidades pequeña y grande) y el ARNm, que será traducido por otro ribosoma antes de ser degradado o directamente degradado.

Fase de Terminación en Eucariotas

RF-1 reconoce los 3 codones de terminación. RF-2 se une al GTP y produce la liberación del polipéptido desde el ribosoma.

Polirribosomas

Ocurre cuando un mismo ARNm está siendo traducido simultáneamente por varios ribosomas a la vez. Se da tanto en procariotas como en eucariotas. La estructura es una espiral formada por el ARNm a traducir y los ribosomas, con la subunidad menor hacia el centro de la espiral y distanciados entre sí unos 100 Å.

Regulación de la Expresión Génica en Procariotas

Necesidad de Regulación

La regulación se da en todos los organismos debido a necesidades metabólicas. Al ser saciadas, se reprime la síntesis de enzimas o de las enzimas que permitieron saciarlas. En procesos de diferenciación celular, se da una expresión génica diferencial: ciertos genes están inhibidos (heterocromatina) y en otros tipos celulares sí están activados (eucromatina). La regulación se da en distintos niveles, sobre todo en la transcripción.

Requerimientos para la Regulación

Las células deben ser capaces de conectar y desconectar la transcripción de cada gen o grupo de genes. Además, deben ser capaces de reconocer las condiciones ambientales en las que los genes deben ser activados o desactivados. Ejemplo: detección de altos niveles de lactosa induce la expresión de lactasa para metabolizarla, buscando el equilibrio.

Tres Niveles de Expresión

1. Sistema de expresión encendido (ON): Alta expresión de un gen.
2. Sistema de expresión constitutivo: Genes que se mantienen activos permanentemente, intervienen en procesos metabólicos básicos. Son independientes del tipo celular, organismo, etc.
3. Sistema de expresión apagado (OFF): El gen está reprimido, no se expresa.

Genes y Elementos Reguladores

El gen es cualquier secuencia de ADN que se transcriba a una molécula de ARN. La gran excepción son los genes reguladores que intervienen solo en la regulación y no se transcriben (ejemplo: promotores de un gen).

Tipos de Genes Fundamentales:

• Genes estructurales: Codifican proteínas que se emplean en el metabolismo o biosíntesis.
• Genes reguladores: Cuyos productos (ARN o proteínas) interactúan con otras secuencias afectando a su transcripción o traducción.

Elementos Reguladores:

Secuencias que no se transcriben, pero con papel en la regulación de la expresión, siendo reconocidos por ARN o RNP para activar o reprimir la expresión de un gen.

Estructuras de Proteínas Reguladoras para la Unión al ADN

1. Motivo hélice-giro-hélice: 2 alfa hélices separadas por una secuencia llamada giro. La proteína se une al ADN por la región alfa helicoidal, formando un dímero con otra proteína.
2. Dedos de zinc: Dos bucles con forma de dedos que presentan Zn.
3. Cremallera de leucina: Secuencia de leucina con estructura alfa-helicoidal y en el otro extremo un aminoácido de carácter básico por el cual interacciona con el ADN.

Sistemas Enzimáticos Inducibles y Represibles

Sistema Inducible:

Las bacterias se adaptan al ambiente químico produciendo enzimas inducibles solo cuando hay un sustrato específico, llamado inductor. Ejemplo: operón *Lac* en *E. coli*. Se induce cuando hay lactosa. Si solo hay lactosa, se induce el operón *Lac* activando el gen β-galactosidasa.

Sistema Represible:

La presencia de algunas moléculas causa la inhibición de algunos genes. Ejemplo: operón *Trp* en *E. coli*. Mucho triptófano (Trp) inhibe la expresión de los genes que intervienen en el metabolismo de este aminoácido.

Enzimas Constitutivas:

Enzimas que se producen continuamente, independientemente de la composición química del ambiente.

Control Negativo y Positivo

Control Negativo:

Una proteína reguladora que no está presente o está inactiva (conformación) no puede unirse al gen en cuestión, permitiendo que se transcriba a ARNm (sistema conectado). Pero si esta proteína se activa (cambio conformacional), se une al gen correspondiente impidiendo la acción de la ARN polimerasa y bloqueando la expresión de ese gen (sistema desconectado).

Control Positivo:

Una proteína reguladora no presente o inactiva impide la transcripción del gen (impide acción de ARN polimerasa) = sistema desconectado. Si está presente o activa, promueve la transcripción del gen (acción ARN pol).

Elementos que Conforman el Operón

Los genes que participan en la misma ruta metabólica suelen estar agrupados y controlados coordinadamente por un único sitio de regulación = operón = sistema de expresión coordinada de varios genes estructurales que actúan en una misma ruta metabólica. Se compone de:

• Promotor: Reconocido por ARN pol.
• Operador: Secuencia de nucleótidos reconocida por una serie de proteínas reguladoras.
• Genes estructurales: A transcribir.

El operón está adyacente a los genes estructurales que regula. El operón también puede ser regulado por moléculas difusibles del citoplasma: elementos reguladores en trans (proteínas activadoras y represoras a partir de genes reguladores) produciendo:

Control Positivo de la Transcripción:

Si la proteína reguladora se une al operador del operón, se produce la activación del proceso de transcripción y se expresa el gen. Si no está presente o está inactiva, se frena la transcripción y no se expresa el gen (tipo inductor).

Control Negativo de la Transcripción:

Al unirse la proteína reguladora al operador, se detiene la transcripción del gen. Es decir, cuando la proteína reguladora está ausente o inactiva, se produce continuamente la transcripción (tipo represor).

Sistema Inducible Negativo:

El operador está unido a la proteína represora, inhibiendo la transcripción. Si hay inductor, se unirá a la proteína represora produciendo un cambio conformacional del represor, liberándolo del operador y permitiendo la transcripción. El inductor será un precursor de una ruta bioquímica regulada por enzimas que catalizan pasos de esa ruta.

Control Reprimible Negativo:

La proteína represora está inactiva y no puede unirse al operador. Se necesita un correpresor (resultado de la transcripción de genes estructurales que codifican enzimas que producen este correpresor) que, al unirse al represor, cambia conformacionalmente activándolo y permitiéndole unirse al operador para detener la transcripción. Ejemplo: operón *Trp* de *E. coli*.

Control Inducible Positivo:

La proteína reguladora inactiva no se une al operador y no ocurre la transcripción. Cuando hay inductor, se une a la proteína reguladora y la activa por un cambio conformacional para que se pueda unir al operador y permita la transcripción. El inductor sería el precursor de una ruta bioquímica de síntesis.

Control Reprimible Positivo:

Es necesaria la unión de la proteína reguladora para que ocurra transcripción. Si no hay represor, hay transcripción. Pero si hay represor, este se une a la proteína reguladora cambiando su conformación e inactivándola para que no se una y no haya transcripción. El represor suele ser el producto final de una ruta metabólica. Se inhibe una proteína reguladora cuando hay alta concentración del producto.

El Operón *Lac* de *Escherichia coli*

En función de la disponibilidad de nutrientes en el medio, se pone en funcionamiento una serie de genes y rutas metabólicas. Si hay lactosa en el medio, se activa la expresión de genes encargados de su degradación, por lo que es necesario que se incorpore la lactosa al citosol.

La β-galactosidasa hidroliza la lactosa en galactosa y glucosa, o forma alolactosa, que es el inductor del sistema. La enzima transacetilasa: detoxificación de los productos generados por la degradación de la lactosa.

Elementos que Componen el Operón *Lac*: Sistema Inducible por Catabolito

Genes estructurales en tándem que codifican para la enzima β-galactosidasa (*LacZ*) + permeasa de lactosa (*LacY*) + transacetilasa (*LacA*). A la izquierda, operador (*LacO*) y promotor (*LacP*). Más a la izquierda está el gen regulador (*LacI*) con su promotor.

Sistema inducible: Si no hay lactosa, no hay inductor (alolactosa), entonces el represor del gen regulador *LacI* se mantiene unido al operador e inhibe la transcripción. Además, hay una secuencia solapada entre el promotor y el operador, evitando aún más la transcripción (la ARN pol no avanza). Cuando hay lactosa -> alolactosa actúa como inductor uniéndose al sitio alostérico del represor, bloqueándolo y permitiendo la transcripción. La unión del represor al operador no es covalente, es temporal y termina soltándose al entrar lactosa porque se necesita β-galactosidasa para activar el operón del todo. La desunión es espontánea: de repente se separa, se transcribe y si hay lactosa, la β-galactosidasa actuará dando alolactosa que será el inductor para que el sistema se dispare del todo.

Represión por Catabolito

Control positivo de regulación por catabolito, ya que *E. coli* prefiere usar glucosa que lactosa. Si hay glucosa, se favorece su ruta y se reprime el operón *Lac*. Bajas concentraciones de glucosa suponen la activación de la adenilato ciclasa (ATP->AMPc = modulador alostérico positivo de la proteína CAP, la activa). CAP se une al operón *Lac* y curva el ADN permitiendo la unión de la ARN pol al promotor, dando la transcripción del operón *Lac* = degradación de lactosa. Pero si hay mucha concentración de glucosa, esta inhibe la adenilato ciclasa, no se produce AMPc y no se activa CAP, no se une al operón y entonces la ARN pol no puede unirse al promotor y no se da la transcripción.

Pruebas Génicas o Demostración del Modelo del Operón: Experimentos de Jacob y Monod

1. Cartografía génica para estimar la posición y el grado de ligamiento de los genes mediante mutantes de cada región del operón *Lac*.
2. Formación de diploides parciales estables: Permitieron establecer relaciones de dominancia entre los dos alelos y el modo de acción de los represores. Usaron el factor F’: cepas Hfr surgen de la integración del factor F en el cromosoma bacteriano; un corte erróneo de este cromosoma Hfr supone que se libere del factor F’. Si se inserta cerca del operón *Lac* y luego se corta por error, se pueden llevar genes del operón *Lac*, obteniendo un factor F’ de formación de cigotos parciales = merocigotos.

Se partía de bacterias con lactosa como inductor u otro inductor que no se degrade (IPTG). Esto producía un aumento enorme de la expresión de las proteínas, demostrando que son genes coinducibles. Pero si se quitaba el inductor, la síntesis de las proteínas se detenía inmediatamente. Constataron que las bacterias podían conectar y desconectar la expresión de estos genes en respuesta a señales ambientales, en este caso, la presencia de IPTG o de lactosa.

Genes Estructurales: *lacZ*, *lacY* y *lacA*

Cada uno codifica para una proteína diferente; los mutantes *lacZ*- y *lacY*- producen β-galactosidasa y permeasas inactivas; están estrechamente ligados (cartografía), en tándem; regulación coordinada.

Gen Regulador *lacI*

El uso de mutantes constitutivos de los genes estructurales permitió ver que existía un locus I: región alejada de un gen regulador que codificaba para una proteína represora.

• Locus I+: Es inducible, con IPTG se sintetiza β-galactosidasa y permeasa = estirpe silvestre.
• Locus I-: Constitutiva, se sintetizan las proteínas haya o no haya inductor.

Alelo I+ domina sobre I-; I- actúa en trans: Solo hay expresión cuando el inductor (lactosa o IPTG) está presente. El carácter recesivo de I- demuestra que en el merocigoto I+/I- el represor actúa en trans: el represor activo se une al operador y se bloquea la transcripción. Los mutantes I- sintetizan un represor inactivo que es incapaz de hacer nada haya o no lactosa, IPTG… Pero si se trata del merocigoto I-/I+ sí se produce un bloqueo cuando no hay inductor, ya que el I+ > I-.

El mutante Iˢ: No se induce la expresión de proteínas en presencia de IPTG. Viendo que:

• I+ es inducible.
• IˢZ+Y+ está reprimido (no se expresa nada).
• IˢZ+Y+/F’ I+: Alelo Iˢ > I+.

Iˢ domina porque su represor carece de un sitio funcional de unión al inductor y entonces nunca se expresan los genes haya o no inductor. Conclusión: el represor tiene dos sitios diferentes:

• Dominio de unión al ADN: Alterado en los mutantes I-, impidiendo la unión y produciendo la expresión de los genes.
• Dominio alostérico de unión con el inductor: Alterado en Iˢ. El represor no puede ser desactivado ya que no se le puede unir el inductor, entonces nunca se produce la expresión de los genes, haya o no inductor.

El Operador, *lacO*

Los mutantes Oᶜ permiten la expresión de genes en presencia de represor activo. O+: sistema inducible; O+: Z+>Z-; Oᶜ es constitutivo; O actúa en cis: el represor activo es incapaz de unirse al mutante Oᶜ, los genes se expresarán de forma constitutiva si están en cis.

Promotor, *lacP*

Unión de ARN pol para el inicio de la transcripción. Sus mutaciones dominan en cis: ARN pol no reconoce y no se da la transcripción.

El Operón *Trp* de *Escherichia coli*: Sistema Reprimible Negativo

Contiene 5 genes estructurales: *trpE*, *trpD*, *trpC*, *trpB*, *trpA*, que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de triptófano (Trp) a partir de un precursor. Incluye una región líder, región operadora y promotora. El gen regulador está alejado del operón con su promotor: codifica una proteína represora que requiere de un correpresor para su activación.

Operón *Trp*

Con bajos niveles de Trp en la célula, se produce la expresión de genes estructurales que intervienen en la síntesis de Trp. El propio Trp actúa como correpresor que, al unirse al represor inactivo, lo activa, haciendo que pueda unirse al operador y se detenga la transcripción. Así se regula su propia ruta de síntesis, inhibiendo la transcripción cuando haya altas concentraciones de Trp.

Experimentos de Yanofsky: La Atenuación

Descubrió otro control superpuesto al mecanismo básico represor-operador: la atenuación. Usó mutantes constitutivos que presentaban una deleción de la región líder. Esto suponía un aumento de 10 veces de los niveles de transcripción basal cuando la proteína represora está unida a la región operadora. Es decir, eran capaces de expresar los genes estructurales habiendo o no represor activo unido al operador. Luego aisló los ARNm policistrónicos del operón *Trp*, viendo que a los mutantes de deleción les faltaba la región reguladora en la secuencia líder, dando una tasa de transcripción muy alta al no estar atenuada: un nuevo sistema de control.

Análisis del Nuevo Control

Se aisló y secuenció ARNm en mutantes *Trp*- codificantes del represor inactivo:

• A alta concentración de Trp, la transcripción es baja e incompleta.
• A baja concentración de Trp, la transcripción era completa y muy alta.

Si ahora a este mutante se le aplicaba una deleción en la región atenuadora, producía una expresión constitutiva (siempre se expresan los genes) y una completa transcripción (todos los ARNm se completaban). Por tanto, la región atenuadora actúa como un terminador de la cadena de ARNm, que en presencia de Trp detiene la transcripción.

Demostración de la Atenuación

El ARNm tiene secuencias que permiten apareamientos intracatenarios, dando estructuras de tallo-lazo. La región líder codifica para un pequeño péptido que permite la síntesis de Trp. El emparejamiento intracatenario del ARNm depende de la disponibilidad de Trp:

• Baja concentración de Trp: Se transcribe la región líder y se forma una estructura de tallo-lazo que no actúa como terminador de la transcripción.

A alta concentración de Trp: El Trp actúa como correpresor y se detiene todo, pero puede separarse del represor y permitir la transcripción dando el péptido líder; bloquea el apareamiento y se forma una estructura tallo-lazo que sí es un terminador de la transcripción.

Existe un doble control en la regulación del operón *Trp* de *E. coli*.

Mecanismo de Atenuación de *Bacillus subtilis*

Solo si la concentración de Trp es alta, ocurre la unión de la proteína TRAP (proteína atenuadora) al ARN del triptófano, formando una estructura que determina la aparición de una estructura tallo-lazo = horquilla de terminación. Cuando las concentraciones de Trp son bajas, la proteína anti-TRAP interviene en el mecanismo de regulación uniéndose a TRAP, impidiendo que se una al ARNm e impide la terminación de la transcripción.

El Fago Lambda

Es un complejo de operones.

• Ciclo lítico: Digestión de ADN huésped, replicación del ADN fago, formación de nuevos fagos y lisis para salir.
• Ciclo lisogénico: Formación de profago cuando las condiciones son desfavorables.

Contiene 40 genes en 4 operones. El genoma es dúplex y lineal en la cápside, pero circular dentro de la bacteria.

Operones del Fago Lambda:

• Operón represor: Genes cuya regulación determina que el fago siga uno u otro ciclo y se integre en el cromosoma bacteriano.
• Operón temprano de la derecha: Genes que codifican para el proceso de replicación del fago.
• Operón temprano de la izquierda: Genes que codifican proteínas implicadas con el proceso de integración.
• Operón tardío: Genes implicados en el ensamblaje de los componentes del virus y la lisis de la bacteria huésped.

El Operón Represor Dirige la Entrada en Lisis o Lisogénesis del Fago Lambda

Gen *N*: importante en ciclo lítico, codifica la proteína N que es antiterminadora. El represor CI o lambda: importante en ciclo lisogénico. Gen *Cro*: ciclo lítico. Gen *CII*: establecimiento del ciclo lisogénico. Operador izquierdo entre *N* y *CI*. Operador derecho: entre *CI* y *Cro*. El represor CI inhibe la transcripción de genes alrededor del represor.

Ciclo Lisogénico:

Se expresa el represor CI (codifica el represor lambda). El represor lambda reconoce los operadores derecho e izquierdo y bloquea el promotor izquierdo, no hay transcripción del gen *N* ni del *Cro* ni *CII*. Alta concentración de represor lambda produce unión a OR3, deteniendo la transcripción del represor lambda para lograr un equilibrio.

Ciclo Lítico:

La ausencia de represor lambda permite la transcripción de los genes del virus y su reproducción y lisis: proteína N, Cro… La proteína N es antiterminadora, uniéndose al terminador entre *Cro* y *CII* va a bloquear su acción, permitiendo la transcripción de *Cro* que bloquea el promotor CI, evitando la aparición del represor lambda.

Unión Competitiva a la Región OR3 (Antagónica)

Si primero se une CII -> ciclo lisogénico. Pero si es Cro -> impide transcripción de CI, ciclo lítico. Altas concentraciones de glucosa en el citosol bacteriano huésped producen una cascada de señalización celular que inhibe el gen que codifica para CII, produciendo un ciclo lítico. Pero si hay poca glucosa: se forma CII que se une antes que Cro al OR3 (formando CI), dando el ciclo lisogénico.

Mutaciones y Daños en el ADN que Producen Ciclo Lítico

La luz UV y los agentes mutagénicos inducen el ciclo lítico. El ADN dañado dispara la respuesta SOS. En los años 40 se observó que si bacterias con el fago λ insertado en el genoma eran irradiadas con luz UV, este se desinsertaba y se producía ciclo lítico. La luz UV dañaba el ADN y se produce el sistema de reparación SOS, además de la síntesis de la proteína RecA, implicada en la replicación. Las altas concentraciones de esta RecA inactivan a CI pasándolo de la forma dimérica (activa) a la forma monomérica (inactiva), de forma que ya no reconoce las regiones operadoras y se expresan los genes *N* y *Cro*, desencadenando el ciclo lítico.

Regulación de la Expresión Génica en Eucariotas

Diferencias en Regulación Génica Procariotas vs Eucariotas

• El genoma eucariota es más extenso.
• Los eucariotas tienen distintos tipos celulares; la regulación génica permite la diferenciación celular.
• El ADN está organizado de forma más compacta.
• Los genes eucariotas no están organizados en operones (no hay secuencias reguladoras comunes).
• La información génica está en el núcleo.
• El ARN debe ser procesado y transportado desde el núcleo al citoplasma.
• El ARNm de eucariotas tiene una vida media mucho más larga (por compartimentalización).

Niveles de Regulación de la Expresión Génica en Eucariotas

El ADN está en forma de cromatina: eucromatina = genes que se transcriben, genes activos; heterocromatina = genes que no se transcriben, son inactivos y deben sufrir una remodelación de la cromatina para ser transcritos.

• Regulación transcripcional: El transcrito primario es procesado a ARNm maduro que viaja del núcleo al citoplasma donde se traducirá.
• El polipéptido resultante sufrirá modificaciones estructurales postraduccionales (metilación, glucosilación, acetilación, fosforilación, plegamiento por chaperonas).

Remodelación de la Cromatina

En el núcleo interfásico, cada cromosoma ocupa un territorio cromosómico separado de los demás. Entre estos territorios están los dominios intercromosómicos, con muy poco ADN.

Cromatina:

Conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas en el núcleo eucariota que forma el cromosoma eucariótico.

Cuando un Gen se Expresa:

La zona del ADN del cromosoma en cuestión se sitúa en la superficie del territorio cromosómico para que sea más accesible toda la maquinaria de transcripción + remodelación de la cromatina = descondensarse para el acceso de las proteínas reguladoras, ARN pol…

Eucromatina:

Forma activa de la cromatina, genes transcripcionalmente activos y ribosomales que se expresan en todas las células.

Heterocromatina:

Forma inactiva condensada en cuya formación participan proteínas adicionales.

• Heterocromatina constitutiva: Carece de información genética = centrómeros y telómeros.
• Heterocromatina facultativa: Estado heterocromático reversible que depende de la etapa de desarrollo y del tipo celular.

Niveles de Organización de la Cromatina

Distintos grados de condensación.

• Molécula bicatenaria de ADN: 20 Å.
• Cadena de nucleosomas + histonas.
• Estructura de Solenoide: 300 Å.

Microcónvulas agrupados en dominios en bucle de 3000 Å, que dan lugar a cromosomas metafásicos. El ADN se puede compactar hasta 10000 veces. Viene acompañado de octámeros de histonas.

Las Histonas y los Genes que las Codifican. Variantes Histónicas

Cada histona tiene una cola N-terminal flexible con sitios para modificaciones covalentes: acetilaciones, desacetilaciones, metilaciones, ubiquitinaciones (suele ser en residuos de Lys y Arg). La unión de las histonas del octámero se da por el dominio globular central.

Variantes de Histonas:

• H3 presenta una variante que es H3.3 en genes activos.
• H3 centromérica (CenH3): En los centrómeros de los cromosomas, relacionada con la formación de los cinetocoros.
• De H2A hay 4 variantes: H2AX: reparación del ADN, en levaduras es la histona principal; H2AZ: segregación cromosómica; MacroH2A: está en la inactivación del cromosoma X en mamíferos, silenciamiento génico; H2ABBD: en el cromosoma X activo.
• H2B tiene la variante spH2B: En los espermatozoides, empaquetando cromatina.
• H4 es la única histona nucleosómica que no presenta variantes.

Remodelación de la Cromatina: Complejos Remodeladores

Los genes transcripcionalmente activos son degradados por la DNAsa I; los genes inactivos no, ya que, al estar condensados, están protegidos. Los genes activos presentan regiones hipersensibles en dirección 5’, donde está el promotor, los genes de regulación… Para que un promotor pase de un estado inactivo a activo, se debe modificar la estructura de la cromatina con el fin de permitir el acceso al aparato transcripcional.

La Remodelación de la Cromatina:

Es el desplazamiento o reorganización de los nucleosomas, dependiente de energía y necesario para la activación o inactivación de los genes de transcripción y reparación del ADN lesionado. El octámero de histonas es desplazado, exponiendo la región del ADN a proteínas reguladoras por el complejo remodelador mediante la unión de ciertos factores proteicos que se unen a la ARN pol y se produce la transcripción.

Cambios Producidos por los Complejos Remodeladores:

• Los nucleosomas se deslizan, dejando un hueco donde estaba el octámero de histonas y que será reconocido por la maquinaria de transcripción.
• También puede desaparecer algún nucleosoma temporalmente, dejando un hueco libre en el ADN.

Complejos Remodeladores de Cromatina:

Dependen de energía en forma de ATP, por eso están asociados a una ATPasa para modificar y desplazar nucleosomas. Tipos:

• SWI/SNF (activación transcripcional)
• ISWI (represión transcripcional)
• CHD (represión transcripcional)
• IN80/SWRI (intercambio de histonas canónicas por una variante)

SWF/SNF:

Alteran la estructura de los nucleosomas. Procesos:

1. Alteración de los contactos entre ADN-proteínas: El nucleosoma se desliza y se expone el ADN.
2. Alteración de la posición del ADN en el nucleosoma: El ADN se separa del nucleosoma.
3. Remodelación de la partícula central del nucleosoma.

Los complejos remodeladores no contienen subunidades que se unan a secuencias específicas de ADN; la identificación de sitios de la cromatina es específica de represores y activadores. Factores proteicos específicos se unen al ADN donde las secuencias están accesibles. El complejo remodelador se une al factor y se produce la remodelación de la cromatina.

Modificación de las Histonas Regula la Función de la Cromatina

En el octámero de histonas, la interacción entre estas se lleva a cabo por su región globular y las colas N-terminal y C-terminal, dándose modificaciones covalentes por adición de grupos químicos: acetilo, metilo, fosforilo, ubiquitilo. Las modificaciones suelen ser en Lys, Arg y Ser, y se agregan o eliminan de forma dinámica.

Hipótesis del Código de Histonas:

La combinación de modificaciones específicas en determinados residuos de histonas actúan cooperativamente. Un mismo residuo puede sufrir varias modificaciones covalentes distintas. La modificación covalente de histonas permite la creación de sitios de unión de proteínas capaces de cambiar propiedades de la cromatina (reconocen las modificaciones y se unen al ADN). Son:

• Proteínas con bromodominio: Complejos remodeladores, reconocen blancos acetilados.
• Proteínas con cromodominio: Proteínas con HP1 que marcan heterocromatina. Reconocen blancos metilados.

Acetilación/Desacetilación de Histonas:

La modificación más importante de histonas. Acetil transferasas de histonas (HAT). Histonas desacetiladas (+) están muy unidas al ADN, el nucleosoma se compacta. Cuando se añaden grupos acetilo, se compensan las cargas + y -, quedando el ADN más suelto, las colas son repelidas y las secuencias de nucleótidos que envuelve el octámero quedan más accesibles. Los complejos de histonas desacetilasa (HDAC) desacetilan las histonas y el ADN del octámero queda más compacto.

Conclusión Acetilación:

La acetilación permite la transcripción y la desacetilación impide la expresión de los genes al revertir la remodelación del ADN. Ciertas secuencias del gen van a ser detectadas por una proteína activadora y el complejo HAT se unirá a esta. Ocurre una remodelación de la cromatina con desplazamiento de nucleosomas, haciendo que el ADN quede libre y ocurra la transcripción. Las acetilaciones se detienen en un determinado punto por secuencias aislantes reconocidas por proteínas aisladoras que, al unirse, bloquean a las HAT y ya no hay más acetilación ni transcripción.

La acetilación es reversible: Una vez se transcribe el ARNm, se produce una desacetilación de histonas por HDAC que, junto a una proteína represora, se une al ADN, vuelve a cargar (-) la cromatina condensándola. Su avance puede ser parado por proteínas aisladoras.

Metilación de Histonas y ADN:

El ADN también puede sufrir metilaciones covalentes: metilación en secuencias 5’CpG3’ = citosinas se metilan interviniendo en la regulación, dando 5-metilcitosina. Los genes Housekeeping deben estar activos siempre dado que sus productos de transcripción deben ser empleados por las células. Se espera mantener la proporción teórica de nucleótido G-C; sin embargo, a veces las C se metilan dando 5-metilcitosinas = Timina. Estas mutaciones se toleran en zonas no codificantes. Pero a nivel evolutivo hay una reducción de la proporción C-G.

En un gen de mantenimiento, el promotor no está metilado ya que se expresa constantemente en todas las células. Las metilaciones de histonas se dan en ciertos puntos gracias a las proteínas que reconocen la metilación de C, uniéndose y reclutando complejos HDAC de desacetilación de histonas, provocando la condensación de la cromatina.

Las proteínas SET (metilasa de histonas) reclutan MBD para añadir grupos metilo en las colas de histonas. Estos serán reconocidos por proteínas con cromodominios que reclutan enzimas metilasas del ADN.

Relación entre la Metilación de Histonas y el ADN:

La metilación del ADN se asocia con inactividad transcripcional; la metilación de las histonas con la activación o inactivación transcripcional. La metilación del ADN no siempre es la causa de la formación de la heterocromatina.

Fosforilación de Histonas:

Puede ocurrir en diferentes histonas y variar de un octámero a otro.

• Fosforilación en Thr11 de H3: Una quinasa que actúa en mitosis: relacionada con segregación cromosómica.
• Otra quinasa, PRK1: Activación de ciertos genes diana de andrógenos.
• Otra quinasa, CHK1: Activación transcripcional de ciertos genes de la H3 por acetilación en K9 y K14.

Conclusión Fosforilación:

Relacionada con regulación transcripcional, apoptosis, progresión del ciclo celular, reparación cromosómica y regulación génica en desarrollo.

Regulación Génica a Nivel Transcripcional

Ensamblaje del Aparato de Transcripción Basal en Eucariotas:

Promotor regulador y promotor mínimo. TFII-D se une al promotor mínimo por la TBP y reconoce la caja TATA, permitiendo el ensamblaje del complejo transcripcional basal. Para una mayor transcripción, interviene el promotor regulador con un activador que necesitará un coactivador o no para unirse al complejo basal sin unirse al ADN.

Ejemplo: Genes GAL de Levadura:

Los genes GAL participan en el metabolismo de la galactosa. Promotor regulador con secuencia reguladora (UASg).

• En ausencia de galactosa, la proteína GAL4 se une a la secuencia reguladora UASg, y se une otra proteína, la GAL80. Se produce la transcripción basal de los genes GAL.
• La presencia de galactosa activa la transcripción y se une a GAL80, estimulando la transcripción de proteínas implicadas en la incorporación y degradación de la galactosa.

Conclusión: La presencia de galactosa induce la transcripción de los genes implicados en su metabolismo.

Modelo del Proceso de Control de la Transcripción de GAL:

El promotor regulativo tiene la secuencia UASg y se une a proteínas GAL4. Tiene un promotor izquierdo (GAL10) y uno derecho (GAL1). Cuando hay galactosa, la proteína GAL3 se une a GAL80, impidiendo que entre al núcleo y así ocurra la transcripción de los genes. Los dedos de Zinc son los dominios de unión al ADN que tiene la proteína GAL4 para dar la transcripción.

Cuando no hay galactosa: La proteína GAL80 está activa y se exporta al núcleo para unirse a GAL4 e impedir la transcripción.

Estructura de la Proteína GAL4:

La proteína GAL4 presenta unos dominios de unión al ADN con motivos de dedos de Zinc en el N-terminal. Se une al surco mayor del ADN. Hacia el extremo C-terminal tiene un dominio de activación en una región acídica (con muchos aminoácidos de carga -).

Procesamiento:

1. El dominio de activación se une a proteínas remodeladoras de la cromatina (SWI/SNF) y modificadoras de histonas para dar acceso al ADN = remodelación de la cromatina.
2. Se unen acetiltransferasas (SAGA), añadiendo grupos acetilo a las colas de las histonas, lo cual relaja la unión histonas-ADN, dando mayor acceso al ADN para la transcripción.
3. Ensamblado de la maquinaria transcripcional basal: Transcripción de GAL10 y GAL1, las cuales son necesarias para dar la transcripción mayor.

Otro Mecanismo de Control de los Genes GAL: Represión por Catabolito:

La regulación de los genes GAL está regulada por otro mecanismo de control: represión por catabolitos. Hay preferencia siempre a glucosa antes que galactosa.

En presencia de glucosa: Se inhiben los genes que codifican las enzimas del metabolismo de la galactosa. La proteína Mig1 se activa en presencia de glucosa y se une al ADN (no en UASg), reclutando el represor Cyc8-Tup1. Este recluta a las enzimas HDAC (desacetilasas de histonas), haciendo la cromatina más compacta e impidiendo la transcripción.

Formas de Actuar de los Represores:

1. Compiten por los sitios de unión al ADN de los activadores: El sitio nunca está vacío para los activadores.
2. Unión al sitio de unión de los activadores específicos.
3. La presencia del represor impide el ensamblaje de la maquinaria de transcripción basal.

Secuencias Intensificadoras o Enhancers:

Aguas arriba del promotor del gen que regulan. Tienen distintas secuencias reconocidas por proteínas importantes para la activación eficaz del aparato de transcripción basal. Esta unión forma un plegamiento del ADN, haciendo que el promotor y el intensificador se acerquen. El intensificador se une a distintas proteínas activadoras que forman el complejo intensificador e interaccionan con todo el aparato transcripcional basal, activando su función.

Los intensificadores se encuentran en cis con los genes que regulan y pueden activar la expresión de distintos genes a la vez. Las secuencias aislantes entre dos intensificadores inhiben el efecto del intensificador sobre otro gen que no corresponde.

Regulación Coordinada de Genes

Dos genes relacionados en el mismo proceso de regulación no están uno a continuación del otro, pero su regulación sí es coordinada. Son regulados a través de secuencias consenso que van a ser comunes a genes que se expresan de forma coordinada. Ejemplo: elemento termosensible – responde a calor – CNNGAANTCCNNG.

Otro Ejemplo: Metalotioneína:

Tiene muchos elementos de respuesta a diferentes estímulos. Su gen se expresa cuando hay metales pesados en el medio; los secuestra y expulsa de la célula porque son tóxicos. En un mismo promotor regulativo va a haber varios elementos respuesta. Los elementos respuesta MRE y MRE se van a unir a proteínas en presencia de metales pesados (respuesta), activando la expresión del gen de metalotioneína. Existe el intensificador TRE que se le une AP1. GRE es un elemento de respuesta para esteroides que activa la expresión de ese gen al unirse a la proteína receptora de esteroides.

Conclusión: La presencia de un mismo elemento de respuesta en genes diferentes permite que un único estímulo active varios genes. También, diferentes estímulos pueden activar el mismo gen por activación de elementos de respuesta. Si al elemento regulador común de 3 genes se une una proteína activadora, se produce la transcripción coordinada de estos 3.

Regulación Postranscripcional

Procesamiento Alternativo del ARN:

El ARNm sufre un proceso de maduración por modificación de sus extremos y el splicing (eliminación de intrones).

Splicing Alternativo Dando Lugar a Proteínas Distintas:

Varias proteínas diferentes a partir de un mismo gen. La cola poli(A) se puede añadir en distintos puntos del ARNm.

Splicing Alternativo en Virus SV40:

Lo sufre el ARNm que codifica para el antígeno T del virus SV40 de mamíferos.

• Si está presente el SF2 (factor de Splicing 2), ocurre el splicing alternativo, dando un ARNm con un fragmento adicional que codifica para el antígeno T.
• Si no está el SF2, se da un splicing normal y el fragmento para el antígeno T es eliminado como si fuera un intrón.

Tanto el antígeno T como el antígeno t son inhibidores del p53, es decir, el SV40 está relacionado con ciertos tumores.