Aislamiento de ADN: Pasos y Propiedades de Sustancias Clave

A continuación, se detallan los pasos implicados en el aislamiento de ADN, haciendo énfasis en las propiedades de las condiciones o las sustancias empleadas:

• Detergente: Facilita la lisis de la membrana celular (compuesta por proteínas, azúcares y una bicapa lipídica). Al romperse la membrana celular, se puede acceder a la membrana nuclear, permitiendo la salida de los ácidos nucleicos.
• Solución salina: Ayuda a que el ADN se disuelva y las proteínas se precipiten, facilitando su separación.
• Agua destilada: Se utiliza para disminuir la concentración de sales, lo que provoca la precipitación del ADN, haciéndolo visible y recuperable.
• Mortero: Empleado para la destrucción mecánica de las células, facilitando la ruptura de sus paredes y membranas para liberar el contenido intracelular.
• Etanol: Se añade al final del proceso para inducir la precipitación de los ácidos nucleicos (ADN y ARN), ya que son insolubles en alcohol frío.

Comparación entre Métodos de Extracción de ADN de Laboratorio y Kits Comerciales

La principal diferencia entre un protocolo de extracción de ADN básico de laboratorio y un kit comercial radica en el uso de proteinasa K en los kits comerciales. Esta enzima es crucial para degradar las proteínas presentes en las membranas celulares y la bicapa de fosfolípidos, creando aberturas que desestabilizan y degradan su estructura molecular, lo que facilita la liberación del ADN.

En cuanto a los pasos y sus funciones, los métodos de extracción básicos y los kits comerciales muestran similitudes. Sin embargo, la diferencia más notable es el costo. Un kit comercial puede oscilar entre 500 y 1000 dólares debido al equipamiento de enzimas, proteinasa K y otros compuestos especializados. Por otro lado, un método de extracción básico puede tener un costo significativamente menor, entre 2 y 10 dólares.

Comparación de Protocolos de Extracción de ADN: Pasos Comunes y Ventajas

Al comparar el protocolo tradicional básico (con cloroformo), el protocolo alternativo (con solución salina) y el protocolo de extracción directa por medio de microesferas magnéticas, se identifican pasos y ventajas comunes:

• Purificación: Es esencial para obtener ADN de alta calidad, eliminando contaminantes como ARN, proteínas y otros residuos celulares.
• Ruptura de la membrana celular: Este paso es fundamental en todos los métodos para liberar las muestras de ADN o ARN, según el ácido nucleico que se desee obtener.

La inclusión de ciertas etapas, como el uso de proteinasa K o microesferas magnéticas, ofrece ventajas significativas en términos de pureza, rendimiento y velocidad del proceso, aunque a un costo mayor.

Importancia de la Estimación de la Concentración de ADN

Es fundamental realizar la estimación de la concentración de ADN para cuantificar los resultados obtenidos en la fase analítica de purificación. La concentración de ADN es un parámetro crítico para diversas aplicaciones en biología molecular, como:

• Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Requiere una cantidad específica de ADN de partida.
• Digestión enzimática: La actividad de las enzimas de restricción depende de la concentración de ADN.
• Electroforesis: La visualización y análisis de fragmentos de ADN se optimiza con concentraciones adecuadas.

Conocer la concentración asegura que se utilice la cantidad mínima requerida de moléculas para cada técnica, optimizando los resultados y la eficiencia del proceso.

Significado de las Lecturas de Densidad Óptica (OD) a 260nm y 280nm

La absorción de ácidos nucleicos (ADN y ARN) se mide a 260 nm (OD₂₆₀) para estimar su concentración. Cada unidad de OD₂₆₀ corresponde aproximadamente a 50 µg/mL de ADN de doble cadena.

La lectura a 280 nm (OD₂₈₀) se utiliza para evaluar la pureza de la muestra, específicamente la contaminación por proteínas, ya que estas absorben fuertemente a esta longitud de onda. La relación OD₂₆₀/OD₂₈₀ es un indicador clave de pureza:

• Si la relación es mayor a 1.6, la muestra se considera suficientemente pura para la mayoría de las aplicaciones.
• Si la relación es mayor a 2.0, puede indicar la presencia significativa de ARN junto con el ADN, o una subestimación de la concentración de ADN debido a la presencia de contaminantes que absorben a 280 nm.

Migración de Fragmentos de ADN en Geles de Agarosa

Un fragmento de ADN de 10 kb no migra más rápido que un fragmento de 1 kb en un gel de agarosa, a pesar de tener más grupos fosfato y, por lo tanto, una mayor carga negativa. Esto se debe a que la migración del ADN en electroforesis en gel de agarosa depende principalmente del tamaño molecular y de la capacidad de la molécula para moverse a través de la matriz porosa del gel.

Los fragmentos de ADN más pequeños, como el de 1 kb, pueden moverse más fácilmente a través de los poros del gel de agarosa, que son de menor tamaño. Por el contrario, un fragmento de 10 kb es considerablemente más grande y su movimiento se ve más obstaculizado por la red del gel, lo que resulta en una migración más lenta. La carga negativa es proporcional al tamaño, por lo que la relación carga/masa es constante para fragmentos de ADN, y la fuerza impulsora es proporcional a la carga. Sin embargo, la resistencia del gel es mayor para moléculas más grandes, lo que domina el efecto de la carga.

Función de los Tampones de Electroforesis y Otros Tipos

La función principal de los tampones o buffers de electroforesis, como el TAE 1X, es mantener un pH estable durante la electroforesis y proporcionar la conductividad necesaria para que el ADN, que está cargado negativamente (debido a la pérdida de protones de sus grupos fosfato), migre hacia el ánodo (polo positivo) en un campo eléctrico.

Otros tampones de electroforesis comunes utilizados en el laboratorio incluyen:

• TBE (Tris-Borato-EDTA): Es un tampón muy común. La diferencia principal entre el TAE y el TBE radica en su capacidad de tamponamiento y en la migración de las moléculas de ADN. El TBE tiene una mayor capacidad de tamponamiento y es más estable que el TAE, lo que lo hace adecuado para electroforesis prolongadas. Se utiliza a menudo para fragmentos de ADN más pequeños y para geles de agarosa con mayor concentración (ej., 2%).
• EDTA (Ácido Etilendiaminotetraacético): Aunque no es un tampón por sí mismo para la electroforesis, es un agente quelante de cationes divalentes (como Mg²⁺). Se incluye en muchos tampones (como TAE y TBE) y soluciones de almacenamiento de ADN para inhibir la actividad de las nucleasas (enzimas que degradan el ADN), ya que estas requieren iones divalentes como cofactores.

La elección entre TAE y TBE a menudo depende del tamaño de los fragmentos de ADN a separar y de la duración de la electroforesis. Por ejemplo, el TAE es preferido para fragmentos de ADN más grandes y para geles de agarosa de baja concentración (ej., 0.8%), mientras que el TBE es más adecuado para fragmentos más pequeños.