Recombinación Genética y Tecnología del ADN Recombinante
El reordenamiento de la información genética dentro y entre moléculas de ADN comprende diversos procesos conocidos como recombinación genética.
Tipos de Recombinación Genética
Se dividen en al menos tres clases principales:
- Recombinación Genética Homóloga: Consiste en el intercambio genético entre dos moléculas de ADN cualesquiera que compartan una región extensa de secuencia casi idéntica.
- Recombinación Específica de Sitio: Los intercambios solo tienen lugar en una secuencia de ADN particular.
- Transposición del ADN: Normalmente interviene un segmento corto de ADN con la capacidad de trasladarse de un lugar a otro del cromosoma (CR).
Recombinación Genética Homóloga
En bacterias, la recombinación genética homóloga es básicamente un proceso de reparación del ADN y, en este contexto, se denomina reparación del ADN por recombinación.
En los eucariotas, la recombinación homóloga puede desempeñar diversos papeles en la replicación y en la división celular, entre los que se encuentra la reparación de las horquillas de replicación bloqueadas.
Este proceso implica el intercambio entre cromátidas homólogas estrechamente asociadas por recombinación homóloga.
Recombinación Específica de Sitio
- Produce reordenamientos precisos de ADN.
- Este proceso está limitado a secuencias específicas.
- Todos los sistemas de recombinación específica de sitio requieren una enzima denominada recombinasa y una secuencia única de ADN corta sobre la que actúa la enzima.
- Estas recombinaciones tienen lugar en prácticamente todas las células, pero sus funciones están especializadas y varían en gran medida de una especie a otra.
Transposición del ADN
La recombinación que tiene lugar por movimientos de elementos transponibles se conoce como transposición, y los elementos involucrados son los transposones.
Las bacterias tienen dos tipos de transposones:
- Secuencias de inserción (transposones simples): Contienen solamente las secuencias requeridas para la transposición y los genes para las proteínas (transposasa) que promueven el proceso.
- Transposones complejos: Contienen uno o más genes, además de los necesarios para la transposición.
Todos los transposones bacterianos tienen cortas secuencias repetidas en cada extremo que sirven de lugares de unión a la transposasa.
Tecnología del ADN Recombinante
- La metodología bioquímica para comprender un proceso biológico complejo consiste en el aislamiento y estudio in vitro de sus componentes individuales.
- Existen numerosas técnicas que permiten analizar y manipular la información genética de un sistema biológico.
- Manipular implica: localizar, aislar, cortar, estudiar, insertar, etc., un gen.
Técnicas Utilizadas en Ingeniería Genética
La utilización de enzimas de restricción (nucleasas) permite la rotura específica del ADN, lo que facilita enormemente el aislamiento y la manipulación de los genes individuales.
La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN hace posible determinar los límites precisos de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica.
Hibridación de los ácidos nucleicos: Hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o de ARN con una gran exactitud y sensibilidad, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
Clonación del ADN: Se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmidos, virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula de ADN puede ser reproducida generando muchos miles de millones de copias idénticas.
Ingeniería génica: Se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden reinsertar en células u organismos.
Enzimas de Restricción
- Son endonucleasas capaces de cortar de modo específico y reproducible el ADN de doble hebra.
- Hidrolizan un enlace fosfodiéster en cada hebra.
- Se obtiene ADN fragmentado que puede ser analizado y manipulado más fácilmente.
- Hay tres tipos de endonucleasas de restricción: I, II y III.
Tipos I y III: Simultáneamente tienen actividad de endonucleasa y metilasa. Necesitan ATP.
Tipo II: Son las más empleadas. No necesitan ATP.
Tipos de Corte
- Extremos cohesivos: Algunas enzimas de restricción (ER) realizan cortes indentados en las dos hebras de ADN, que dejan de 2 a 4 nucleótidos desapareados en cada extremo resultante.
- Extremos romos: Otras ER cortan ambas cadenas de ADN en los enlaces fosfodiéster opuestos, y no dejan bases desapareadas en ningún extremo.
Clonación de ADN
- Clonar significa hacer copias idénticas.
- Consiste en obtener muchas copias idénticas de un fragmento de ADN previamente aislado.
- Básicamente, se inserta un fragmento de ADN determinado en un vector de clonación para obtener un gran número de copias iguales.
- La clonación ha hecho posible la genómica y la proteómica modernas, es decir, el estudio de los genes y las proteínas a nivel celular y de los organismos enteros.
Estrategia de Clonación
- Aislamiento del ADN que queremos clonar. Preparación del inserto.
- Unión del fragmento que queremos clonar al vector de clonación.
- Transformación: Introducción del vector en la célula hospedadora.
- Selección de la célula hospedadora con el ADN que queremos clonar.
- Análisis del gen o fragmento clonado.
Aislamiento del ADN
Las endonucleasas de restricción reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas. Estas “tijeras” moleculares reconocen sitios específicos y cortan el ADN, siendo una herramienta fundamental en la Ingeniería Genética.
Vectores de Clonación
Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.
Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar, y ser inocua para la célula hospedadora.
Tipos de Vectores de Clonación (según el tamaño del inserto)
- Plásmidos (hasta 10 Kb)
- Virus (bacteriófagos) (hasta 20 Kb)
- Cósmidos (hasta 40 Kb)
- Vectores BACs y YACs
Plásmidos
- Son moléculas circulares que se replican con independencia del cromosoma del huésped.
- Extracromosómicos.
- Fenotipo seleccionable: genes de resistencia a antibióticos.
- Se introducen en células bacterianas mediante un proceso denominado transformación, con un amplio rango de hospedadores.
Bacteriófagos
El bacteriófago λ tiene un mecanismo muy eficiente para introducir sus 48.502 pb de ADN en la bacteria y puede utilizarse como vector para clonar fragmentos de ADN algo mayores. Permiten la clonación de hasta 23.000 pb.
Cósmidos
Los cósmidos son vectores híbridos que utilizan partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica. Además, contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado.
BACs y YACs
- Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad (factor F) de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana. Los BAC pueden transportar insertos de hasta 300 kb.
- Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno. Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb.
Introducción del Vector en la Célula Hospedadora
Existen distintos métodos para introducir el vector:
- Transformación
- Transducción
- Conjugación
- Microinyección
- Bombardeo de partículas, etc.
Transformación
Las células, junto con el ADN plasmídico, se incuban a 0ºC en una solución de cloruro cálcico y, a continuación, son sometidas a un choque térmico elevando rápidamente la temperatura hasta 42ºC. El ADN plasmídico se incorpora.
Clonación: ¿Para qué?
- Generalmente, la clonación es un primer paso en un proyecto de biotecnología.
- Proporciona la posibilidad de analizar un gen, manipularlo, hallar su secuencia e incluso modificarlo.
Aplicaciones de la Tecnología del ADN Recombinante
- Obtención de proteínas recombinantes.
- Obtención de proteínas modificadas.
- Organismos modificados (transgénicos): Mejorar, añadir o silenciar una característica de un microorganismo, una planta o un animal.
- Crear modelos animales de enfermedades.
- Diagnóstico de enfermedades.
- Etc.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
La PCR es una técnica de amplificación in vitro que permite obtener múltiples copias de una secuencia determinada de ADN. Se basa en la síntesis de ADN por una ADN polimerasa.
Ciclo de 3 Etapas de la PCR
- Desnaturalización.
- Hibridación de los cebadores.
- Extensión de los cebadores.