Extracción de Ácidos Nucleicos en Vegetales

1. ¿Qué tipo de material genético se encuentra en los vegetales?

Los vegetales, al ser organismos eucariotas, contienen material genético distribuido en tres ubicaciones principales:

• ADN nuclear (el genoma principal).
• ADN mitocondrial (mtDNA).
• ADN cloroplástico (cpDNA), ya que poseen cloroplastos.

Por lo tanto, durante la extracción se aísla ADN de las tres fuentes: nuclear, mitocondrial y cloroplástico.

2. Indique 3 diferencias entre la extracción de Ácidos Nucleicos a partir de células eucariotas y células procariotas

Las diferencias clave en el proceso de extracción se deben a las estructuras celulares distintas:

1. Pared Celular

   Las células vegetales (eucariotas) tienen una pared celular rígida compuesta principalmente de celulosa, que debe ser desintegrada mecánica o químicamente de forma más agresiva que la pared celular bacteriana (procariota), la cual es más delgada y compuesta de peptidoglicano.

2. Contaminantes Celulares

   Las células vegetales contienen una alta concentración de polisacáridos (como el almidón) y compuestos fenólicos que se liberan durante la lisis y pueden inhibir las reacciones posteriores (como la PCR). Las células procariotas generalmente presentan menos interferencia de estos polímeros complejos.

3. Organelos

   En eucariotas vegetales, la lisis debe ser lo suficientemente robusta para liberar el ADN del núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos, lo cual requiere condiciones de ruptura específicas que no son necesarias en procariotas.

3. ¿Cuál es el método de elección para extraer ácidos nucleicos en vegetales y por qué?

El método de elección más común y robusto para la extracción de ADN de plantas es el método basado en sales y/o el uso de reactivos quelantes (como el CTAB), a menudo modificado para manejar la alta presencia de polisacáridos y fenoles.

La razón principal es que el CTAB (Bromuro de Cetiltrimetilamonio), un detergente catiónico, ayuda a solubilizar las membranas celulares y, crucialmente, forma complejos con los polisacáridos y los polifenoles, permitiendo su separación y eliminación durante las etapas de lavado y precipitación. Esto resulta en un ADN más puro y libre de inhibidores.

4. Investigue otro método de extracción de ácidos nucleicos en vegetales y descríbalo brevemente.

Otro método ampliamente utilizado, especialmente para obtener ADN de alta calidad rápidamente, es la Extracción basada en columnas de sílice (Spin Columns).

Descripción Breve

Este método utiliza la propiedad de que el ADN se une selectivamente a una membrana de sílice en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas (como el cloruro de guanidinio). El proceso consta de cuatro etapas:

1. Lisis: Se rompe la pared celular y se liberan los componentes celulares.
2. Unión: Se añade la muestra lisada a una columna que contiene la membrana de sílice, y el ADN se une a ella.
3. Lavado: Se utilizan soluciones de lavado (generalmente a base de etanol) para eliminar proteínas, sales, polisacáridos y otros contaminantes.
4. Elución: Se añade un buffer de baja concentración salina (como agua libre de nucleasas o buffer TE) que desnaturaliza la unión ADN-sílice, permitiendo que el ADN purificado sea recuperado en el tubo colector.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

1. ¿Cuál es la diferencia entre PCR en tiempo real y PCR en punto final?

PCR en Punto Final (PCR Convencional)

• La amplificación del ADN se realiza por ciclos, pero la detección del producto se hace al final de la reacción, generalmente mediante electroforesis en gel de agarosa.
• Solo permite saber si el ADN está presente o no (cualitativo) y observar el tamaño del fragmento.
• No cuantifica el ADN inicial.
• Es menos sensible y depende de la calidad del gel y la interpretación visual.

PCR en Tiempo Real (qPCR)

• La amplificación del ADN se monitorea en tiempo real durante cada ciclo, mediante sondas fluorescentes o colorantes intercalantes.
• Permite la cuantificación absoluta o relativa de la cantidad inicial de ADN.
• Es más sensible, precisa y rápida.
• No requiere geles, ya que la detección es óptica dentro del equipo.

2. ¿Qué es la Taq Polimerasa y cuál es su función principal?

La Taq polimerasa es una enzima ADN polimerasa aislada de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en aguas termales.

Función Principal

Su función es sintetizar nuevas cadenas de ADN durante la PCR, agregando nucleótidos a partir de un cebador (primer).

Características Clave

• Es termoestable (tolera temperaturas >90°C).
• Trabaja óptimamente a ~72°C.
• Se usa en PCR porque soporta ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento sin desnaturalizarse.

3. ¿Cuáles son los componentes del mix de reactivos para la amplificación?

El master mix de PCR generalmente contiene los siguientes componentes esenciales:

1. ADN molde: La secuencia que se quiere amplificar.
2. Taq polimerasa: Enzima encargada de sintetizar el nuevo ADN.
3. Cebadores (primers): Secuencias cortas que delimitan la región a amplificar.
4. dNTPs (nucleótidos: dATP, dGTP, dCTP, dTTP): Materia prima para formar las nuevas cadenas de ADN.
5. Buffer de reacción: Mantiene el pH y las condiciones iónicas adecuadas.
6. MgCl₂: Cofactor esencial para la actividad de la Taq polimerasa.
7. Agua libre de nucleasas: Para ajustar el volumen final.

En qPCR puede incluirse además:

• Colorante fluorescente (SYBR Green) o sondas específicas (TaqMan).

4. Investigue y describa la PCR convencional

La PCR convencional, también llamada PCR en punto final, es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar fragmentos específicos de ADN mediante ciclos térmicos repetidos.

Etapas del Proceso

1. Desnaturalización (94–95°C): El ADN molde se separa en dos hebras simples.
2. Alineamiento o Apareamiento (50–65°C): Los cebadores se unen a las secuencias complementarias del ADN.
3. Extensión (72°C): La Taq polimerasa sintetiza nuevas hebras de ADN a partir de los cebadores.

Este ciclo se repite 25–35 veces, lo que produce millones de copias del fragmento objetivo.

Detección del Producto

El producto de PCR no se mide durante la reacción. Al finalizar, se coloca una alícuota en un gel de agarosa y se visualiza mediante un colorante (como bromuro de etidio o GelRed). La presencia de una “banda” indica amplificación.

Características Principales

• Permite amplificar ADN de forma cualitativa (presencia/ausencia).
• No cuantifica la cantidad de ADN.
• Es más económica, pero menos sensible que la PCR en tiempo real.
• Se usa para diagnóstico básico, clonación, identificación de organismos, y análisis forense.

Secuenciación Genética

1. Indique 3 ventajas de la Secuenciación

La secuenciación de ácidos nucleicos ofrece avances significativos en la investigación y el diagnóstico:

1. Identificación Precisa: Permite determinar el orden exacto de nucleótidos (A, T, C, G) de un gen o genoma completo, lo cual es crucial para identificar mutaciones, variantes patogénicas o clasificar especies.
2. Diagnóstico Molecular: Facilita el diagnóstico rápido y específico de enfermedades infecciosas (identificando el patógeno) o genéticas (identificando la alteración hereditaria).
3. Estudios Evolutivos y Funcionales: Al conocer la secuencia, se pueden comparar genomas entre organismos para entender relaciones filogenéticas, y predecir la estructura de proteínas o la función regulatoria de una región génica.

2. ¿Cuál es la secuencia genética de un microorganismo?

La secuencia genética de un microorganismo es el orden exacto y específico de los nucleótidos que forman su ADN o ARN (Adenina, Timina, Citosina y Guanina en ADN; Adenina, Uracilo, Citosina y Guanina en ARN).

Este orden actúa como un código molecular que contiene toda la información necesaria para que el microorganismo viva, se replique, produzca proteínas, exprese sus factores de virulencia y se adapte al ambiente.

En otras palabras, la secuencia genética constituye:

• El genoma completo del microorganismo, si se analiza toda su información hereditaria.
• Una región genética específica, si solo se secuencia un fragmento (como el gen 16S rRNA en bacterias o el ITS en hongos).

3. Enuncie y explique 3 tipos de muestra para realizar secuenciación

El tipo de muestra depende del objetivo de la secuenciación (ADN genómico, ARN viral, ARN mensajero, etc.):

1. Muestra de Tejido Sólido (Ej. Biopsia o Hoja)

   Se utiliza para obtener el ADN genómico de organismos complejos (animales o vegetales). Es la muestra ideal para estudios de variación genética, diagnóstico tumoral o secuenciación de genomas completos, ya que el material celular está intacto y se puede aislar ADN de alta calidad.

2. Muestra Líquida (Ej. Sangre, Suero o Fluidos Corporales)

   Esta muestra permite aislar tanto el ADN genómico de células circulantes como el ADN libre circulante (cfDNA) o ARN viral. Es muy usada en diagnóstico no invasivo o para detectar patógenos que circulan en el torrente sanguíneo.

3. Cultivo Puro de Microorganismo

   Es la muestra de elección cuando el objetivo es secuenciar el genoma completo de una bacteria o levadura. Se debe cultivar una muestra pura en un medio adecuado hasta obtener una biomasa suficiente para extraer el ADN de alta pureza necesario para el ensamblaje genómico.