Clonación del ADN

• Clon: Población de células descendientes, todas ellas de una misma célula inicial.
• Clona (del griego «clon» = retoño, vástago): Se refiere a la multiplicación de una planta podada y plantada a partir de sus ramas para obtener plantas hijas idénticas (genéticamente) a la madre.
• Clonación Molecular del ADN: Inserción de un segmento de ADN extraño, de una determinada longitud, dentro de un vector que se replica en un huésped específico.
• Implica la manipulación dirigida del material genético por recombinación del ADN in vitro, y su multiplicación dentro de una célula hospedera donde se sintetizan copias idénticas.

La Recombinación in vitro del ADN

La recombinación in vitro del ADN comprende la purificación de material genético a partir de cualquier fuente, su manipulación y modificación enzimática en tubo de ensayo, su unión química con otras moléculas de ADN, su introducción a células hospederas y la selección de aquellas células que adquirieron el ADN.

Clonamiento Posicional: (Aplicación) Técnica para identificar genes, basada en su localización dentro de un cromosoma. Técnica asociada con la detección de riesgo a enfermedades genéticas.

Endonucleasas de Restricción

Definición

• Son proteínas multiméricas que protegen a los organismos contra la invasión de ADN extraños, a los que modifican o restringen. Se conocen tres grupos de estas enzimas de restricción: tipo I, tipo II y tipo III.
• Las endonucleasas de restricción tipo II son las verdaderas «tijeras moleculares» porque reconocen y cortan los mismos pares de bases que son secuencias palindrómicas de 4 a 6 pb.
• Al cortar, pueden dejar o no algunos nucleótidos sin aparear, a lo que se le denomina extremos salientes. En caso contrario, se les llama extremos romos (o rasurados).

Preparación de ADN Recombinante

• Ejemplos:

Ava I 5’C’ Py C G Pu G       SacII 5’C C G C’G G
          G Pu G C Py’ C5’           G G’C G C C5’

Ava II  5’G G (A/T) C C        SmaI 5’C C C ‘G G G
          C C (T/A) G G5’           G G G ‘C C C5’

Ava III 5’A T G C A T         XmaI 5’C’C C G G G
          T A C G T A5’           G G G C C’C5’

EcoRI 5’G’A A T T C          HaeIII 5’G G’C C
          C T T A A’G5’           C C’G G5’

• Isoesquizómeros

  Isoesquizómeros: Enzimas aisladas de diferentes géneros que reconocen y cortan la misma secuencia de ADN.

  Se denominan isoesquizómeros imperfectos a las ER que reconocen las mismas secuencias, pero cortan en distintas posiciones.

Nomenclatura

La primera letra del género del que se aisló y las dos primeras letras de la especie, en letras itálicas.

La letra del nombre de la cepa de origen.

El número romano indica el orden de descubrimiento.

• Las ER fueron clave para el manejo del ADN, ya que siempre reconocen la misma secuencia en las mismas condiciones de reacción. Esto permite construir mapas, ubicar genes y generar fragmentos con extremos conocidos, facilitando su manejo, caracterización y clonación.

Los fragmentos obtenidos pueden separarse por electroforesis en gel, donde migran a velocidades diferentes que dependen de su tamaño y carga eléctrica neta.

Luego pueden unirse enzimáticamente con ADN ligasa (Bacteriófago T4 o E. coli).

Mapa de Restricción

• Es un diagrama que muestra la distribución lineal de los sitios de corte de las enzimas de restricción en un fragmento de ADN. Constituyen una herramienta para caracterizar el ADN y detectar en él cambios naturales o inducidos experimentalmente.
• Es un mapa físico, generado por digestión del fragmento de ADN con distintas enzimas de restricción y midiendo los fragmentos resultantes.

La Clonación del ADN Comprende:

• La purificación del material genético a partir de cualquier fuente (síntesis química o enzimática, cromosomas, virus, mitocondrias, etc.).
• Su manipulación y modificación enzimática en un tubo de ensayo, esto es, su unión química con otras moléculas de ADN (ADN vector que permita continuar su manipulación de manera segura y estable).
• Su introducción en células hospederas (E. coli, Bacillus subtilis, S. cerevisiae, hongos, células de insectos y de mamíferos).
• La selección de aquellas células que adquirieron el ADN modificado.

Elementos Clave en un Experimento de Clonación de ADN:

• El vector o vehículo molecular (plásmido, virus, fago);
• El fragmento de ADN de interés (ADN exógeno o «pasajero»);
• Secuencia poliligadora;
• Endonucleasas de restricción;
• ADN-ligasa, para sellar fragmentos;
• Una célula huésped (Escherichia coli, Agrobacterium sp., o Saccharomyces cerevisiae) para expresar el ADN de interés.

Vectores o Vehículos Moleculares

• Son entidades extracromosomales circulares con capacidad de replicación autónoma, conocidas como replicones. Esta categoría incluye los plásmidos, virus y bacteriófagos.
• Virus y bacteriófagos se utilizan para clonar fragmentos largos de ADN (hasta más de 20 kilopares de bases).
• Los plásmidos no poseen infectividad ni cápsula proteica que les permita sobrevivir en latencia fuera de la célula. Están presentes en una gran variedad de organismos procariotas y eucariotas, y se identifican con múltiples funciones: resistencia a antibióticos, metales pesados y radiaciones, entre otras.

Funciones de los Plásmidos:

• Producen bacteriocinas (ciertas endonucleasas),
• Fijan el nitrógeno atmosférico (en ciertas bacterias del suelo),
• Desarrollan tumores en plantas, y
• Producen determinantes de virulencia bacteriana.
• Son de tamaño variable (de 1 a 200 kilopares de bases).

Características de un Vector de Clonación Eficiente:

• Un origen de replicación.
• Genes marcadores para selección visual.
• Varios sitios de clonación útiles.
• Tamaño pequeño que facilite su entrada a la célula hospedera, y
• Secuencia nucleotídica completamente conocida.

Otras Características Deseables en un Vector:

• Genes para mantenimiento y replicación:
• Para retención, partición y regulación, y orígenes de replicación alternativos.
• Elementos para transcripción: promotores, terminadores, atenuadores y antiterminadores.
• Elementos para traducción: sitio de unión al ribosoma, codón de inicio, codones de término. Elementos para modificaciones post-traduccionales.

Modificaciones Post-Traduccionales de Proteínas

• De las proteínas.
• Modificación de los aminoácidos mediante adiciones como la de grupos acetilo, carboxilo, hidroxilo, fosfato, metilo, N-formilación.
• Glicosilación.
• Acilación.
• Procesamiento proteolítico (zimógenos).
• Poliproteínas, que se cortan alternativamente. (ej. hormonas peptídicas producidas en el lóbulo anterior de la pituitaria).

Resumen de Características Clave del Vector:

• Buena caracterización funcional y total caracterización estructural.
• Tamaño pequeño (eficaz transformación y buena recepción de ADN exógeno o de interés).
• Estabilidad dentro del huésped (no “segregue”).
• Presencia de marcadores de selección visual.
• Presencia de múltiples sitios únicos de restricción dentro de los genes marcadores de selección.
• Capacidad de “amplificar“ el número de copias.

Métodos para Generar Segmentos de ADN in vitro:

• Digestión por endonucleasas de restricción: Útil para obtener poblaciones de fragmentos con tamaños homogéneos.
• Síntesis enzimática por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o por transcripción inversa (RT) a partir de ARNm.
• Síntesis química (de oligonucleótidos).
• Rotura mecánica del ADN en condiciones controladas (cizallamiento para obtención de fragmentos largos al azar, de más de 10 kpb).

Transcriptasa Inversa

Es una ADN-polimerasa que sintetiza una hebra de ADN complementaria a una hebra de ARN o un híbrido ADN-ARN.

Es útil para genes eucarióticos que contienen intrones en su ADN genómico. Las colas de poli-A del ARNm maduro se utilizan para hibridar colas de poli-T complementarias a la cola anterior y tener un extremo 3’OH para que se sintetice primero una hebra de ADNc y luego un gen de ADN de doble hebra, utilizando la Nucleasa S1 y la ADN polimerasa I.

ADN-Ligasa

• Cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre el grupo 3’ OH de un segmento y el extremo 5’ fosfato del segmento adyacente.
• Factores que afectan la eficiencia de la ligasa:
  • El tipo de extremos (romos vs. cohesivos).
  • La temperatura, óptima 12ºC para extremos romos y de 12º a 37ºC para extremos cohesivos.
  • Concentración relativa de elementos conforme a su peso (1 mol de vector por 1 mol de ADN de interés).
  • Concentración de la ligasa.

Transformación o Transfección

Introducción de un vector recombinante en una célula huésped. Esta técnica, útil en la ingeniería genética, reúne características de la infección por bacteriófagos y la transformación (incorporación directa de ADN exógeno en el genoma celular modificado).

Transformación

• Paso del ADN recombinante in vitro a través de las membranas de las células hospederas y su incorporación en la célula como un elemento estable.
• Factores que determinan la eficiencia de la transformación:
  • Los que afectan la entrada, y
  • Los que afectan la persistencia y herencia del material genético después de la entrada.

Tipos Básicos de Transformación

• Métodos químicos: Utilizan cationes divalentes como Mg, Ca y Mn, además de un choque térmico.
• Métodos físicos: Incluyen la electroporación (por pulsos cortos de fuertes campos eléctricos), la microinyección y la biobalística (para células vegetales).
• Métodos biológicos: Como la conjugación y la transducción.

Características del Proceso de Transformación:

• Lograr desestabilizar (rotura discreta de la membrana por uso de cationes divalentes (Ca++, Mg++), polianiones (dextrano), infección por virus, microagujas, microbalística, pulso eléctrico).
• Formación del complejo calcio-fosfato que estimula la entrada y estabilización del ADN transformante.

Células Competentes

• Aquellas capaces de tomar ADN de su ambiente. Ejemplos: Bacillus subtilis, Pneumococcus (competentes naturales).
• Mandel y Higa (1970) lograron competencia artificial de E. coli (breve choque térmico a células creciendo rápido a 4°C en solución hipotónica de CaCl₂ (Mg++)).
• La frecuencia de transformación es influida por:

1. Eficiencia de formación de esferoplastos.
2. Viabilidad celular después de tratar con CaCl₂.
3. Pureza, conformación y concentración del ADN.

Identificación de Células Transformadas

• Se conocen varias maneras, que pueden agruparse en dos:
• Método de identificación indirecto: Consiste en inactivar un gen marcador (resistencia a antibiótico) que confiere una actividad vital en medio selectivo. Es indispensable realizar un doble plateo, uno con medio selectivo y otro sin él, porque la presión de selección puede ocasionar la muerte de las células no recombinantes.
• Método directo: Requiere un vector que codifique una función letal (sensibilidad a selenio) o una complementaria (β-galactosidasa).
• El método de selección directa de recombinantes utiliza como marcadores: genes letales y genes reporteros. En el primer caso, solo los genes interrumpidos por la transformación logran la supervivencia. Este método es muy útil cuando se requiere analizar un elevado número de clonas. En el segundo caso (genes reporteros), se busca una actividad detectable.

Proteínas Heterólogas

• Las que son producto de genes recombinantes (insertados en un vector molecular), que fueron introducidos en una célula huésped que expresa (produce/fabrica) estas proteínas.

Genes Heterólogos

• Los que no pertenecen al organismo que actúa como hospedero y fabricante de la proteína heteróloga o recombinante.

Tipos Celulares Utilizados para Producir Proteínas Heterólogas:

• E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, Hongos (Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei), células de insectos (Spodoptera frugiperda, Autographa californica), células de mamíferos (de tipo hibridoma).

Proteínas Terapéuticas Producidas por ADN Recombinante

• Albúmina sérica (regeneración de proteínas sanguíneas).
• Anticuerpos monoclonales (diagnóstico, cáncer).
• ADNasa I (Fibrosis quística).
• Factor de crecimiento epidérmico (quemaduras).
• Gonadotropina coriónica (infertilidad femenina).

Insulina (Diabetes).

• Interleucinas (cáncer, desórdenes inmunológicos).
• Vacunas diversas (prevención de enfermedades).