TP9: Ensayo de esterilidad

TP9: Ensayos de esterilidad: Se realizó con la finalidad de determinar la ausencia de microorganismos (MO) en los lugares de fabricación, como en los medicamentos.

Objetivos

• Determinar el número de microorganismos presentes.
• Lograr la inhibición de los microorganismos.
• Determinar la presencia de conservantes.

OBJETIVOS específicos:

• Reconocer la importancia del control higiénico de medicamentos.
• Interpretar los criterios microbiológicos utilizados.
• Verificar si el medicamento analizado se ajusta a la normativa vigente.
• Realizar control de esterilidad del medicamento: control general, inactivación del conservante, pruebas definitivas.
• Poner en práctica diferentes técnicas microbiológicas: vertido en placa, inoculación de microorganismos de prueba, etc.

TP8: Kirby‑Bauer (difusión en disco)

Descripción: El microorganismo es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se incuban por 16–18 horas a 35–37 °C. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentración del antibiótico es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede clasificarse en categorías de sensible, intermedio o resistente (S, I o R).

Debido a que las pruebas de sensibilidad in vitro dan solamente una idea aproximada de la acción inhibitoria contra los microorganismos, es necesario tener presente que la verdadera respuesta es la respuesta clínica del paciente luego de administrada la dosis adecuada. Existen microorganismos que muestran sensibilidad variable a los antibióticos de uso común: estafilococos, enterobacterias, Pseudomonas, enterococos y algunos bacilos Gram negativos no fermentadores de glucosa. Debe realizarse el antibiograma con cepa pura, utilizando varias colonias de aspecto semejante del germen a probar.

Cultivo para anaerobios

Medios: agar sangre (sólido) y tioglicolato (líquido) deben ser enriquecidos porque los anaerobios no utilizan el oxígeno como fuente de energía.

CIM (Concentración Inhibitoria Mínima)

Diferencias entre CIM y Kirby‑Bauer:

• La CIM es un método de dilución; Kirby‑Bauer es de difusión.
• Dificultades de la CIM: costo y complejidad, lleva más tiempo.
• Ventaja de la CIM: se obtiene la mínima concentración con la que se inhibe el crecimiento. Kirby‑Bauer indica si la cepa es sensible o resistente a la concentración presente en el disco.

Categorías y criterios microbiológicos para productos farmacéuticos

CAT 1

• Categoría 1.1: Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras graves. Ausencia de gérmenes revivificables.
• Categoría 1.2: Productos para ser administrados por vía inhalatoria.
  • Recuento de aerobios viables totales: no más de 10 por g o mL.
  • Ausencia de Enterobacteriaceae en 1 g o mL.
  • Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g o mL.
  • Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o mL.

CAT 2

Productos para ser administrados por vía nasal, ótica, rectal, tópica y vaginal.

• Recuento de aerobios viables totales: no más de 10² por g o mL.
• Ausencia de Enterobacteriaceae en 1 g o mL.
• Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en 1 g o mL.
• Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o mL.

CAT 3

Productos para ser administrados por vía oral.

• Recuento de aerobios viables totales: no más de 10³ por g o mL.
• Recuento de hongos y levaduras: no más de 10² por g o mL.
• Recuento de Enterobacterias: no más de 10² por g o mL.
• Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (solamente en forma farmacéutica oral líquida) en 1 mL.
• Ausencia de Staphylococcus aureus en 1 g o mL.
• Ausencia de Escherichia coli en 1 g o mL.
• Ausencia de Salmonella en 1 g o mL.
• (Productos farmacéuticos cuyas materias primas se consideren fuentes de contaminación).
• Ausencia de anaerobios sulfitorreductores en 1 g o mL.

Recuentos y estándares de microorganismos

• Aerobios: en placa, PCA, 2–7 días, 35 °C.
• Anaerobios: líquido, tioglicolato, 2–7 días, 35 °C.
• Hongos: placa, Sabouraud, 2–7 días, 30 °C.

Preparación del inóculo (PREP DEL INÓCULO)

Se toman 2 a 3 colonias bien aisladas con un ansa y se introducen en 5 mL de caldo de tripticasa soya. Se pretende obtener la turbidez del testigo (0,5 de la escala McFarland).

Preparación de las placas con el medio de cultivo según Kirby‑Bauer

Debe utilizarse Agar de Mueller‑Hinton, no otro. El pH es de 7,2 a 7,4. Este agar es el más indicado porque:

• Presenta buena reproducibilidad de resultados lote a lote.
• Es pobre en contenido de timina (la timina compite con las sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas, lo que daría falsas resistencias).
• Brinda buen crecimiento a muchos patógenos.
• Se dispone de gran cantidad de datos sobre pruebas de sensibilidad con este medio.

Se deben verter por placa de 25 a 30 mL de agar fundido para obtener una altura de 4 mm. Esto es importante para no obtener halos excesivamente reducidos o ampliados. Preparadas y envueltas, pueden conservarse de 4 a 7 días en la heladera. Para evitar las gotas de condensación en la superficie del agar, secar las placas 15 a 30 minutos invertidas en estufa a 37 °C antes de la siembra.

Antibiograma (procedimiento)

Antibiograma: Se toman 2–3 colonias puras con el ansa ojal y se diluye en caldo de tripticasa soya hasta 0,5 en la escala McFarland de turbidez. Esquema:

1. Se toma la colonia pura de una caja de Petri.
2. Se diluye hasta turbidez 0,5.
3. Se toma un hisopo y se escurre en la pared el exceso.
4. Se realiza el hisopado en la placa 3 veces, girando cada 60°.
5. Se agregan los monodiscos de antibióticos.

Posibles causas de error: no conseguir la turbidez adecuada, no respetar los conceptos de esterilidad, agregar más o menos de los 4 mm de agar.

Tioglicolato

Medio para microorganismos anaerobios. Es indicador (la resazurina en presencia de O2 cambia a rosa), contiene glucosa como fuente de energía y una pequeña cantidad de agar (para evitar difusión de CO2 y O2). Se agrega vaselina para mantener el ambiente anaeróbico.

TP7: Clasificación según requerimiento de oxígeno

• Aerobios estrictos: requieren presencia de oxígeno para su desarrollo (p. ej., Pseudomonas).
• Anaerobios estrictos: requieren la ausencia de oxígeno para su desarrollo (p. ej., algunas cepas de Clostridium; el documento menciona Salmonella, aunque esta es típicamente anaerobia facultativa).
• Anaerobios facultativos: pueden desarrollarse aun en presencia de oxígeno (p. ej., Staphylococcus aureus).
• Microaerófilos: requieren bajas concentraciones de oxígeno (p. ej., algunos Streptococcus); se cultivan en campana con vela.

Esputo

Tinción directa: Gram (observación de flora y leucocitos).

Cultivo:

• 1. Agar sangre: incubar 35–37 °C, 18–24 h.

Cocos Gram positivos:

• Prueba catalasa: (+) Staphylococcus aureus; (−) Streptococcus pneumoniae.

Bacilos Gram negativos:

• Prueba oxidasa: (+) Pseudomonas; (−) Enterobacteriaceae.

Otros cultivos y materiales

2. Agar chocolate: para Haemophilus influenzae.

Gas Pack (sistema anaeróbico): abrazadera, catalizador de paladio y sobrecargador de anaeróbicos; placas: agar sangre.