TEMA 12. Estructura de los ácidos nucleicos. Requerimientos: – deben permitir explicar la constancia en la transmisión de las carácterísticas hereditarias (continuidad de especies). – explicar la variación que se observa en las carácterísticas hereditarias (proceso de evolución). Por tanto, debe: – almacenar información. – replicarse y transmitirse. – expresar la información (genotipos->fenotipo). – producir variación por mutación. Determinación de ADN como material hereditario. Experimento de Griffith: estudió cepas de Streptococcuspneumoniae: bacterias virulanecia S (cubierta de polisacárido) y bacterias no virulentas R (sin cubierta); al inyectar bacterias muertasviru+ bacterias vivas no viru, los ratones morían y sus cadáveres conténían bacterias virulentas vivas. Se dedujo que existían un factor transformante en bacterias virulentas S que podía ser transmitido a las cepas no virulentas R y adquirir virulencia. Conclusión: Griffith atribuyó que el factor transformante era la capa de polisacáridos. Experimento de Avery, MacLeod y McCarty: reveló la naturaleza química de la sustancia transformante de las bacterias. Descubrieron que solo los extractos de bacterias viru muertas con DNA eran capaces de producir dicha transformación. Deducción: la molécula de ADN es la molécula portadora de información biológica (no las proteínas). Proceso: se destruyeron bacterias viru por calor y formaron diluciones; se aplicaron 3 tratamientos: ADNasas, ARNasas, proteasas; las diluciones tratadas se aplicaron a cultivos de bacterias no viru R; los cultivos tratados con proteasas y RNAasas conténían bacterias R transformadas, pero los cultivos tratados con ADNasas no han transformantes. Conclusión: el ADN es la sustancia transformante. Experimento de Hershey y Chase: replicaron los experimentos en fagos T2. Proceso: reprodujeron el fago T2 en cepas E. coli con aa Cys y Met marcados con azufre radiactivo, dando fagos con cápsides proteicas radiactivas; infección en otro cultivo bacteriano marcando el ADN del fago con P rad (virus marcado); solo los fagos con ADN marcado presentan el marcaje en el interior de las bacterias como en los nuevos fagos (las proteínas marcadas se quedan en la cápside vacía). Conclusión: el ADN es el material hereditario con información genética de los organismos. Estructura primaria de los ácidos nucleicos = Nucleótidos:
secuencia de nucleótidos formando una sola cadena.
3 componentes fundamentales: base nitrogenada, azúcar tipo pentosa y grupos fosfatoNucleósido: base nitrogenada + azúcar tipo pentosa (enlace N-glucosídico). Bases nitrogenadas: constan de un anillo heterocíclico formando por C y N con diferentes sustituyentes. Tipos:
púricas = A y G.

Pirimidínicas:

C, T, U.

Paso de nucleósido a nucleótido: desoxirribosa -> ADN; ribosa -> ARN.
La diferencia radica en la ausencia del grupo –OH en 2C de la desoxirribosa (ARN). Nucleósido-grupos fosfatos por enlace fosfoéster
. El nº de grupos P determina la gran variedad de nucleótidos. Cuando son varios P estos se unen entre sí por enlace anhídrido fosfato
. Y cuando un P realiza doble enlace se forma un nucleótido cíclico por enlace 3,5-fosfodiester
: AMPc, GMPc (señalización celular). Estructura primaria del ADN. Uníón de nucleótidos: la uníón da lugar a cadenas de ácidos nucleicos, en sentido 5’–>3’. Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo P por enlace hidroxilo (5C a 3C) liberando una molécula de agua = enlace 3’,5’-fosfodiester
.Estructura secundaria del ADN: ADN duplexo. Disposición espacial de las dos cadenas de polinucleótidos formando la doble hélice del ADN. Complementariedad de bases. Reglas de Chargaff. – la proporción de Adenina = Timina. – La proporción de Guanina = Citosina. – La proporción de bases púricas A y G = bases pirimidínicas T y C, A+G/T+C=1. – La proporción de A+G y T+C es carácterística de cada especie, existe variabilidad en la composición de las bases nitrogenadas. – Existe una complementariedad de bases entre A y T (2 puentes de hidrógeno), y entre C y G (3 puentes de H). Experimentos de difracción de rayos X: se basa en la desviación de los rayos X cuando inciden en los átomos de una molécula. Rosalind Franklin y Maurice Wilkins descubrieron con esta técnica: – el ADN presenta una estructura fibrilar de 20A de diámetro. – Cada vuelta de hélice mide 34A de longitud. – Cada par de bases dista 3,4A. Modelo de la doble hélice de Watson y Crick. ADN-B: – dos cadenas polinucleotídicas enrolladas alrededor de un eje central que forma una doble hélice dextrógira (giran en sentido horario). – Las cadenas son antiparalelas (una 5-3 y la otra 3-5). – El esqueleto azúcar-fosfato se sitúa al exterior y las bases nitrogenadas perpendiculares al esqueleto, en el interior de este. – Las bases se disponen apiladas a una distancia de 3,4A. – Las dos cadenas quedan unidas por puentes de H entre las bases nitrogenadas: A- -T y C—G (más estables). – Cada vuelta completa de hélice tiene una longitud de 34A. – La molécula de ADN tiene un surco mayor (lugar de reconocimiento de proteínas del ADN) y otro menor (punto donde los dos esqueletos azúcar-fosfato están más próximos). – El diámetro es de 20A. – El ADN tiene 2 regiones: una hidrofílica (esqueleto azúcar fosfato) y otra hidrofóbica (corresponde a los pares de bases).

Carácterísticas para ser una molécula de material hereditario:

– Portar grandes cantidades de información de manera estable. – Replicarse fielmente. – Expresar la información. – Permitir que puedan ocurrir variaciones que hacen posible la evaluación = mutaciones.
 

Modelos alternativos de ADN:

ADN-A:

doble hélice destrógira, corta y gruesa, con 11pb por vuelta. Se da en condiciones experimentales.

ADN-Z:

hélice levógira, larga y delgada. En la regulación de genes y recombinación génica. El ARN como material genético. Experimento de Fraenkel-Conrat y Singer: demostraron que ciertos virus portan ARN como material genético. Utilizaron el virus del mosaico del tabaco: virus con ARN simplexo.

Experimento:

2 cepas distintas del virus y separaron sus componentes, se mezcló de forma que el ARN de la cepa 1 tendría proteínas de la cepa 2. Se vio que los virus con un determinado ARN seguían produciendo las mismas lesiones en la shijas de tabaco que la cepa de la que se extrajo el ARN, es decir, el ARN era el material genético. Estructura del ARN: -cadenas con polaridad 5’-3’. – formadas por ribonucleótidos (ribosa), moléculas más inestables y reactivas. – Uracilo en lugar de Timina. – Síntesis por ARN polimerasa. – Enlaces 5-3-fosfodiester entre nucleótidos. – Estructura helicoidal. – En eucariontes es mayoritariamente monocatenario, pero lo hay bicatenario o combinado de los dos (ARNt).- El ARN es muy flexiblepudiendo formar distintas estructuras. Tipos de ARN y su papel biológico: existen 3 tipos de ARN estructurales (síntesis proteica) cuyos genes se disponen en tándem:

ARNr,

70%, junto con proteínas forma los ribosomas.

ARNm,

7%, transcrito por los genes y codifica la síntesis proteica.

ARNt,

15%, transporta aminoácidos para la síntesis proteica. También existen los ARN menores (no síntesis proteica):
ARNpn, ruptura y formación de enlaces entre los nucleótidos precursores del ARNm, elimina intrones en su maduración. 
ARNn,arn pequeño nucleolar, actúa en la maduración del ARNr.
ARN pequeños de cajal, modifican ARNn y ARNpn.

ARNi,

ARN bicatenario que causa el silenciamiento génico, tipos: ARN pequeño de interferencia (anula un gen por degradación de su ARNm y forma heterocromatina); Micro ARN (regula la expresión génica); ARN piwi interactivos (protegen la línea germinal de los transposones).
ARN largos codificantes, sirven de armazón regulando procesos de actividad génica y heterocromatización del cromosoma X. 

EMA 13. La replicación del ADN. El modelo de Watson y Crick y la replicación del ADN: el mecanismo de replicación debe ser preciso (evitar mutaciones) y rápido. Diferentes tipos de hipótesis sobre la replicación:

Hipótesis conservativa:

cada cadena del ADN engendraría otra cadena complementaria y las dos nuevas cadenas se organizarían formando una nueva cromátida. Quedaría un ADN viejo y otro nuevo.

Hipótesis semiconservativa

:

en cada cromátida de un cromosoma metafásico el doble helicoide (ADN) presentaría una cadena antigua y otra que se acabaría de sintetizar en la interfase = cadena parental + cadena de nueva síntesis. 

Hipótesis dispersiva:

cada cromátida o cadena es una mezcla de fragmentos nuevos y viejos por la teoría del multifilamento. Experimento de Meselson y Stahl: dieron las pruebas de la replicación semiconservativa del ADN. Se usó E. coli en un medio con N marcado (15N), el ADN sintetizado con ese N pesaba más que con el normal; se separaban por centrifugación diferencial y por un gradiente de densidad se logra un equilibrio de F centrífuga y de la fuerza de difusión; se extrae el ADN; el ADN recién sintetizado ocupaba una posición intermedia entre el ADN con 15N y el ADN con 14N (el normal) en el tubo de la centrífuga (se descartó la teoría conservativa). Aparecieron dos bandas en el tubo de la centrífuga: uno híbrido y otro ligero. Se confirmó la hipótesis semiconservativa. Experimento de Taylor-Woods-Hughe: demostró que la replicación del ADN también es semiconservativa en eucariotas. Se marcó la timina -> timina tritiada; se usó colchicina que impide la polimerización de microtúbulos quedando los cromatidios separados. Reglas básicas de la replicación del ADN: – se sintetiza ADN nuevo a partir de desoxirribonucleótidos trifosfatos en sentido 5’-3’. – Las hebras de ADN se separan para formar la horquilla de replicación = burbuja de replicación, las dos cadenas se sintetizan a la vez, pero en direcciones opuestas. – la enzima helicasa rompe los puentes de H entre bases complementarias. – Las topoisomerasas eliminan el superenrrollamiento mediante rupturas transitorias. – La replicación es semidiscontinua
: la síntesis del ADN solo es continuo en la hebra adelantada; la hebra retrasada se copia por fragmentos = fragmentos de okazaki. – la replicación es bidireccional
: comienza en un punto del cual se forman dos horquillas de replicación que avanzan en dos direcciones opuestas. – La replicación se inicia en varios puntos de la cadena de ADN. Las ADN polimerasas: enzima principal de la replicación. – Todos los tipos catalizan reacciones de síntesis de ADN en sentido 5’->3’. – Requieren de un extremo 3’libre (-OH) y una hebra molde complementaria a la que se está replicando(ADN dependientes)
. – Tienen actividad exonucleasa 3’-5’, dando la eliminación de bases erróneas en la cadena de crecimiento, debido a tasa de error de 1 por cada 10^7 nucleótidos incorporados. – Requieren de un fragmento de ARN = primer o ARN cebador para iniciar la síntesis, sintetizado por enzima primasa y encontrado al inicio de la hebra conductora como en cada fragmento de okazaki. – Cebador retirado por actividad exonucleasa de ADN pol I, que elimina y rellena el hueco con ADN complementario. – Huecos empalmados por ADN ligasa.
 ADN pol I: actividad polimerasa 5-3 SI; actividad exonucleasas 5-3 SI; actividad exonucleasa 3-5 SI. Eliminación y sustitución del cebador, reparador de errores en fragmentos de okazaki.

ADN pol II: SI, NO, SI; reparación, es la polimerasa de respaldo, corrige errores, reanuda replicación.   ADN pol III: SI, NO, SI; elongación. ADN pol IV: SI, NO, NO; reparar la hebra retardada. ADN pol V: SI, NO, NO; reparar la hebra retardada y síntesis de ADN de translesión. Componentes requeridos para la replicación. Replisoma: complejo nucleoproteico, maquinaria en la horquilla de replicación que se coordina con reacciones necesarias para la replicación del ADN.

Proteína iniciadora (ADN-A):

se une a la secuencia de iniciación AUG y separa las cadenas.

ADN-helicasa:

desenrolla el ADN en la horquilla de replicación, rompiendo los puentes de hidrógeno entre las bases necesitando ATP.

Proteínas de uníón a cadena simple SSBP:

se une a las hebras desenrolladas para evitar la formación de estructuras secundarias.

ADN girasa:

actividad topoisomerasa, se mueve delante de la horquilla de replicación realizando rupturas transitorias en una de las hebras, evitando que se vuelva a enrollar el ADN.

Primasa:

sintetiza el cebador = ARN corto que aporta el grupo 3’ libre para que se incorporen nucleótidos por enlace 3,5-fosfodiester.

ADN pol III:

añade un nuevo nucleótido al extremo 3’ libre (3`-OH).

ADN pol I:

elimina los cebadores de ARN y los sustituye por ADN.

ADN ligasa:

empalma todos los fragmentos de ADN resultantes.

Iniciación de replicación en procariotas

Modelo de replicación por círculo rodante. (1) La proteína iniciadora ADN-A reconoce el origen de replicación = OriC con 245 pb con secuencias ricas en A-T (menos estables y más fácil de separar). (2) Se forma un bucle de uníóny comienza la separación de ambas hebras -> burbuja de replicación. La helicasa + ATP va rompiendo los puentes de H entre bases separando las hebras. Se unen las proteínas SSB que forman tetrámeros y estabilizan las hebras (evitan estructuras secundarias). La enzima girasa deshace los superenrollamientos que pudieran darse en ambas cadenas liberando la tensión. (3) Síntesis de cebador por primasa que aporta el segmento 3’-OH para el inicio de la actuación de la ADN pol III: sintetiza ADN a partir de la cadena molde. – Hebra conductora: síntesis continua 5-3.-Hebra retardada: síntesis discontinua, se copia por fragmentos = fragmentos de Okazaki (1000-2000pb).

Elongación en replicación en procariotas:

seguir sintetizando ambas hebras (líder y retardada) a ambos lados del origen de replicación. Se van eliminando los cebadores por el ADN pol I (actividad exonucleasa 5->3) y rellena el hueco ya que presenta un 3’-OH. Los fragmentos resultantes de todo el proceso son sellados por la enzima ligasa. Modelo del trombón: como el ADN pol III tiene 2 centros catalíticos: replica la hebra líder y la retardada a la vez. La hebra retardada con su cadena molde se dobla dando un bucle

al que se añaden desoxirribonucleótidos en el extremo 3’de la hebra retrasada, permite el desarrollo de la síntesis en dirección 5’-3’ en ambas cadenas antiparalelas donde la hebra retrasada se dobla y se sintetiza por fragmentos.

Terminación de replicación en procariotas:

la replicación continua en ambos sentidos desde el OriC hasta una determinada secuencia de terminación, Ter, al cual se une la proteína Tus y se detiene definitivamente la replicación. Las dos moléculas de ADN circular bicatenario quedan unidas y se soltarán después.

Excepciones a la replicación típica: replicación por círculo rodante

No todos cumplen el modelo de trombón = factor F de E. coli o genomas de virus.Se parte de un ADN circular duplexocon 2 secuencias: origen de replicación DSO en cadena duplexa y en cadena simplexa la secuencia SSO. La proteína REP se une al origen de replicación DSO y corta una cadena dando un extremo 5’-P al que se une la proteína REP y un extremo 3’-OH que es empleado para la replicación: helicasa separa hebras, proteínas SBB estabilizan, se une el ADN pol III para la síntesis.
La hebra muescada va siendo desplazada y ambas moléculas simplexa y duplexa quedan conectadas por un sitio de corte sobre el que actúa de nuevo REP, separándolas. Conclusión: – las hebras de ADN simplexo sirven de molde para su hebra complementaria. – Se inicia la replicación en la secuencia SSO por síntesis de un cebador.  – También actúa ADN pol y ADN ligasa y girasa. – La molécula de ADN duplexo se libera de REP el cual se inactiva y actúa la ligasa para empalmar los dos extremos de la hebra rota. En algunos virus este segundo corte por la REP no se da, sino que continua la adición de nucleótidos, se forma un concatámero donde se tienen varias copias de ADN.

Replicación en eucariotas

La gran diferencia es la presencia de varios orígenes de replicación al mismo tiempo.
Se debe a una mayor complejidad en el genoma, por lo que es una forma de acelerar la replicación. – Tiene fragmentos de Okazaki más pequeños: 100-200 pb.

Iniciación de la replicación en eucariotas:

el ADN eucariota no tiene secuencias consenso en los orígenes de replicación.
El complejo de iniciación ORC depende de su topología y de las carácterísticas estructurales del ADN. – El avance de la replicación debe coordinarse con la eliminación de la estructura de los nucleosomas = ADN-histonas. – El octámero de histonas se abre en un tetrámero H3-H4 y dos dímeros de H2A-H2B.Los tetrámeros se reparten por igual mientras que los dÌmeros se liberan. • Los nuevos tetrámeros H3-H4 se sitúan en los huecos de las dobles hélices hijas, mientras que los nuevos dímeros junto con los antiguos liberados, se reparten al azar entre ambas hélices, completando los nucleosomas • Unas chaperonas de histonas intervienen en la incorporación de histonas y son reclutadas por el PCNA, mientras que las no histónicas se incorporan rápidamente.

Otras diferencias: ADN pol α: actividad polimerasa 5-3, pero no correctora de pruebas. Inicia la síntesis de ADN y la reparación del ADN, además de tener actividad primasa. ADN pol δ: actividad polimerasa 5-3 y exonucleasa 3-5. Síntesis de la hebra retardada en ADN, reparación y síntesis de ADN translesión. ADN pol &épsilon;: actividad polimerasa 5-3 y exonuclasa 3-5. Síntesis de hebra conductora.

Terminación de replicación en eucariotas:

gran diferencia es la forma de los cromosomas: lineales. Se deben duplicar los extremos también. Si se elimina el cebador de un extremo no puede ser rellenado por la ADN pol I y esto supondría una pérdida de información genética a largo plazo. La enzima telomerasa es la solución ya que sintetiza el fragmento complementario a la cadena molde rellenado el hueco dejado por el cebador. Es una transcriptasa inversa que sintetiza ADN a partir de ARN
. En los telómeros existen secuencias repetidas en tándem = TTAGGG, que protegen el resto de cromosoma de perder información importante. La telomerasa presenta en su estructura una cadena de ARN complementaria a la secuencia repetitiva = es su molde y va añadiendo copias al extremo 3’; después se sintetiza un cebador complementario a partir del cual se sintetiza ADN regenerando los telómeros y alargándolos. Quedaría un pequeño segmento simplexo no codificante que se degradará, si no fuera así y crece daría apoptósis.

La no regeneración de los telómeros está relacionada con procesos de envejecimiento y muerte celular

. Las células tumorales por su capacidad proliferativa dispondrían de la Telomerasa manteniendo los telómeros intactos.

Replicación del ARN:

muchos virus presentan ARN como material genético. Existen 4 mecanismos: Virus del ARN sentido negativo [-ssRNA]:tiene ARN simplexo en sentido negativo: no actúa como ARNm, no se traduce. Es la cadena complementaria a este ARN la que sí se traduciría (sentido positivo).

ARN polimersa es ARN dependiente

El ARN – sería el molde para la síntesis de ARNm (ARN +) y estás servirían de molde para síntesis de ARN – = material genético del virus. Virus de ARN sentido positivo [+ssRNA]: el ARN genómico puede actuar como ARNm (misma información) y puede codificar proteínas víricas. Del ARN + como molde se sintetiza ARN – que sirve de antigenoma el cual es el molde de ARN + como nuevo material genético y el que hizo de molde para el antigenoma se usará de ARNm. Es fácil de entender pame. Síntesis de ARN de doble cadena [dsARN]:virus con ARN duplexo como genoma, tiene una cadena + y otra -. La cadena + = ARNm. La cadena – se replica gracias a una ARN pol dependiente de ARN, tenemos al final proteínas y ARN genómico del virus.

Síntesis de ADN a partir de ARN: retrovirus

Retrovirus como el VIH sintetizan su ADN a partir de su ARN gracias a la enzima transcriptasa inversa = ADN polimerasa dependiente de ARN. Desmontó el dogma de la biología molecular. Proceso: la cápside vírica alberga en su interior el genoma vírico = ARN simplexo + la transcriptasa inversa. La cápside es degradada y el genoma y enzima son liberados al interior del citosol de la célula huésped donde la transcriptasa inversa emplea ARN vírico como molde y sintetiza una hebra del ADN complementario = molécula híbrida. La transcriptasa inversa elimina la hebra del ARN y se va a sintetizar la hebra de ADN complementaria a la híbrida dando -> ADN duplexo con capacidad para integrarse a alguna parte del genoma de la célula huésped, dando un ARN proviral. De esta forma se expresan los genes víricos y se transcribe un ARNm viral que codifica para las proteínas del virus dando partes de virus que se ensamblarán dando virus nuevos que finalizará la lisis celular. 

TEMA 14.

Base molecular de la mutación y la reparación. Mutación:

todo cambio heredado en la información genética determinada por la información de nucleótidos. Son la fuente de variación que se emplea en el análisis genético, es la base sobre la que actúa la selección natural que conduce a la evolución = modificación en las poblaciones naturales y de especies. Es también origen de enfermedades y problemas graves.

Mutaciones según el tipo de células afectadas:

Mutaciones en la línea germinal:

responsables de la mutación en todas las células del individuo descendiente.

Mutaciones en la línea somática:

produce individuos mosaicos, solo afectan al individuo que la sufre, los gametos no portan esa mutación = no será transmitida a la descendencia. El grado de afectación dependerá del momento del desarrollo en el que se produzca.

Mutaciones según su extensión en el genoma: Mutaciones puntuales:

suponen un cambio a pequeña escala en el genoma, por algún cambio en la base nitrogenada o error en el apareamiento o inserción o deleccion de una base (mutaciones indel).
Transición: cambio base púrica-púrica (A-G) o pirimidínica-pirimidínica (C-T). Transversión:cambio púrica-pirimidínica. El cambio de una base supone un cambio en un codón
-> proteína con estructura normal o forma completamente distinta (consecuencias graves). Las mutaciones indel producen un corrimiento en la pauta de la lectura si estas se producen en regiones codificantes del ADN lo cual es poco probable porque las regiones codificantes suponen solo un 1,5% del genoma humano
.  

Mutaciones espontáneas:

espontáneas o inducidas por agentes mutagénicos. La principal fuente son las mutaciones espontáneas endógenas: • errores de la polimerasa durante la replicación del ADN.

•Desplazamiento de la replicación o deslizamiento en el apareamiento de hebras:
debido a secuencias repetidas dando inserciones o deleciones produciendo bucles espontáneos que favorece la deleción en la hebra molde e inserción en la hebra de nueva síntesis. • Cambios químicos espontáneos:
tautomería, despurinización o desaminación.

(1) Cambiostautoméricos:

cambios químicos espontáneos de las bases nitrogenasas a formas químicas alternativas= tautómeras, los más importantes son: formas ceto-enol en Timina y Guanina; formas amino-imino en Citosina y Adenina. Formas ceto-enol en G y T tendrían un –OH dando un anillo. Las formas amino-imino de A y C tienen un doble enlace N–C con el grupo amino externo eliminando el anillo.

Hay un equilibrio entre las formas tautómeras y las normales

El tautomerísmo supone cambios en el apareamiento de bases: C*-A y T*-G. Si no se corrige después de dos rondas de replicación
: se produce transiciones = púrica-púrica, pirimidina-pirimidina.La polimerasa detecta una adenina tautómera e introduce una Citosina en lugar de una Timina, en una segunda ronda de replicación, si no se corrige la forma tautómera se observa una molécula mutada al final.

(2) Despurinización:

cambio químico espontáneo en el ADN que implica la pérdida de una base púrica (A-G) que produce sustituciones de pares de bases = transversiones y transiciones tras varias rondas de replicación. Se rompe el enlace N-glucosídico entre la base nitrogenada y la pentosa formándose un sitio apurínico y como la ADN polimerasa no reconoce ninguna base es incapaz de introducir un nuevo nucleótido complementario, el ADN pol se descuelga y es sustituido por otra ADN pol que introduce un nucleótido al azar (Adenina casi siempre). En la siguiente ronda de replicación ese nucleótido al azar será empleado como molde si no se repara dando una hebra de nueva síntesis con una timina complementaria a la A. Transversiones o transiciones pueden ocurrir. En la molécula persiste el sitio apurínico en la hebra molde, habrá una A en la hebra de nueva síntesis.

(3) Desaminación:

cambios químicos espontáneos en el ADN implicando la pérdida de un grupo amino de una base pudiendo alterar las propiedades de apareamiento. La desaminación de la Citosina produce Uracilo + la desaminación de 5-metilcitosina -> Timina. Si la desaminación del 5-metilcitosina no se repara producirá mutaciones de tipo transición (A-G).

Mutaciones inducidas:

por agentes mutágenos.

Agentes mutagénicos físicos:

radiaciones que producen cambios estructurales en ADN debido a la gran energía que contienen.  Radiaciones UV: formación de enlaces covalentes entre dos pirimidinas (T-C) adyacentes dando un dímero de Tque distorsionan la estructura del esqueleto azúcar-fosfato -> inhibición de la replicación.

La polimerasa al alcanzar ese dímero de T no reconoce dos T y continúa replicando más adelante dando mutaciones por la introducción de cualquier nucleótido en la cadena nueva.

Las radiaciones UV aumentan la aparición de formas tautoméricas en las bases

 Radiaciones ionizantes: energías electromagnéticas capaces de colisionar con moléculas situadas en el interior de las células liberando electrones y radicales libres = muy tóxicos que producen roturas en la cadena de ADN. •por ionización pueden alterar las bases
: G + ROS -> 8-oxi-7,8-dihidrodesoxiGuanina que empareja erróneamente con Adenina (G*-A). •rotura de enlaces
: formación de sitios apurínicoso apirimidínicos por rotura de enlaces N-glucosídicos + rotura en el enlace 3-5-fosfodiester del esqueleto-azúcar dando roturas en la doble hélice y alteraciones de bases = enlaces covalentes cruzados entre dos bases de hebras distintas.

Agentes mutagénicos químicos

(A) Ácido nitroso, HNO2:produce desaminaciones en las bases nitrogenadas, los grupos amino que queden por fuera del anillo será eliminados y sustituidos por gruposceto. • La desaminación de la A -> hipoxantina –C (aparea con C). • La desaminación de G-> xantina –C (no supone problemas). • Timina no sufre desaminación. • Desaminación de Citosina -> Uracilo –A.  Produce mutaciones de tipo transición.

Hidroxilación:

introducción de grupos –OH en las bases. Hidroxilación en Citosina -> hidroxilamina-citosina –A (mutación transición).

Especies reactivas de O2: ROS: daño oxidativo

Radicales libres se forman en la respiración aeróbica, dañando las células y produciendo alteraciones en el ADN. Súperóxido O2-, radicales de hidroxilo –OH y peróxido de hidrógeno H2O2. Existen mecanismos y enzimas que los transforman en compuesto no tóxicos (catalasa o súperóxido dismutasa). Convierten la Guanina -> 8-oxi 7,8-dihidrodesoxiguanina –A (mutación transversión).

Análogos de bases:

análogos de bases nitrogenadas en el citosol de la célula: T = 5-bromouraciloformatautómera enceto –A, y formaenol –G. Produce transiciones tras varias rondas de replicación, requiriendo la incorporación del análogo y su posteriortautomerización.

Agentes alquilantes:

mutágenos químicos que pueden ceder grupos alquino a los gruposceto y amino de las bases nitrogenadas. Eletilmetanosulfato EMS alquila gruposceto de las posiciones 6 de Guanina y 4 de Timina produciendo transiciones. También produce desaminaciones dando transversiones.

AgentesIntercalantes:

las moléculas de carácter aromático, planas y con dimensiones similares a la de un par de purina-pirimidina pueden insertarse entre bases. Provocan distorsiones y producen adiciones o deleciones tras rondas de replicación, reparación (no son reconocidas por correctores) y recombinación. No son reconocidas por polimerasas ni por sistemas de reparación de ADN.

. El bromuro de etidio es un ejemplo de agenteintercalante muy usado en técnicas de electroforesis en gel de agarosa revelando la posición del ADN.
Es capaz de intercalarse entre los pares de bases y emite en el espectro visible al ser irradiado con luz UV, revelando la posición del ADN en el gel. No obstante, este compuesto es un potente agente mutagénico, al igual que las radiaciones UV, por lo que sebe tener cuidado al trabajar con esta técnica de revelado.

Test de Ames:

método que se emplea para poner a prueba el potencial mutagénico de sustancia químicas. Se emplea cepasauxotróficas de Salmonella para la histidina que se introducen en un medio con enzimas hepáticas capaces de transformar algunos compuestos en agentes potencialmente mutagénicos. Algunas bacterias se mezclan con la sustancia de interés, cuya actividad mutagénica se quiere estudiar y se colocan dos placas sin histidina: en la placa control se introducen las bacterias sin el compuesto a estudiar, mientras que en la otra sí. En la placa con crecimiento se observa un crecimiento de colonias bacterianas, por lo que se deduce que las bacterias se han desarrollado en este medio presentan un genotipohis+, han adquirido la capacidad de sintetizar histidina por mutación y por eso se desarrollan en un medio sin histidina. Cualquier sustancia química que aumente significativamente el número de colonias en una placa de tratamiento es mutagénica.

Base molecular de REPARACIÓN de ADN:

los daños en ADN suponen un reto diario para la célula promedio, deben ser reparados, pero estos son muy abundantes y variados.A pesar de que el ADN es muy estable por su estructura química, es bastante inestable debido a las condiciones del metabolismo celular y ambiente que rodea a las células.

Reparación directa de dímeros de Timina:fotorreactivación

Las radiaciones UV producen dímeros de pirimidina (C-T) y sobre este dímero actúa la enzimafotorreactivadora PRE o fotoliasa que emplea luz visible para reparar el dímero rompiendo el enlace covalente.

Reparación por escisión:

escindir bases por rotura del enlace N-glucosídico o escindir nucleótidos enteros en el esqueleto azúcar-fosfato (rotura del 3,5-fosfodiester). (A) Reparación por escisión de bases: elimina la base dañada (por desaminación) y se reemplaza el nucleótido completo mediante la acción de enzimas ADNglucosidasa(un tipo específico por base). La basedespurinizada es escindida del esqueleto azúcar-fosfato por su ADNglucosilasa específica
. Queda un hueco = sitio AP donde una endonucleasa + fosfodiesterasa eliminan el nucleótido cuya base fue lisada y la ADN polimerasa en cuestión introduce el nucleótido correcto. La ligasa une todo.

(B) Reparación por escisión de nucleótidos: se eliminan lesiones voluminosas del ADN que distorsionan la estructura de la doble hélice. Un complejo enzimático recorre el ADN detectando distorsiones y deteniéndose en ellas, por su actividad helicasa se separan las cadenas y quedan protegidas por las SSB, se realiza un corte en la zona lesionada hacia el extremo 5’ y otro de 5 nucleótidos hacia el extremo 3’. La ADN ligasa empalma los fragmentos resultantes.

Reparación de errores de apareamiento (MISMATCH REPAIR):

cuando hay apareamiento de bases incorrecto por introducción de una base en cuestión, se distorsiona la doble hélice.La reparación sería quitar esa base y añadir la buena, pero es necesario que la célula reconozca la base mal apareada ycúal es la hebra molde y cuál la de nueva síntesis. Para ello están las enzimasMuts que detectan la distorsión de la doble hélice. Existe una secuencia, CTAG (cadena nueva), que está metilada (en A) gracias a una ADN metilasa, lo que permite diferenciar ambas cadenas: las adeninas de cadena nueva están sinmetilar, mientras que las decadena moldesí lo estarán. Mutaciones en genes homólogos aMutS yMutL son las responsables de la predisposición a una enfermedad hereditaria autosómica dominante: cáncer colorrectal hereditario sin poliposis. Este mecanismo es muy parecido en humanos y en E.coli, donde fue descrito. La diferencia es que en eucariotas las adeninas no semetilan
. En bacterias: eldesapareamiento es reconocido porMutS, mientras que la secuenciaCTAmetG es leída porMutH. Se forma entonces un lazo conMutS,MutL yMutH. Se producen entonces dos cortes en la hebra de nueva síntesis, uno aguas abajo de la base mal apareada y otras aguas arriba de la secuencia GATC, complementaria a CTAG. El fragmentosimplexo resultante se separa y se forma una mella en la cadena de nueva síntesis. Entonces, el extremo 3′-OH es usado por la ADN polimerasa para polimerizar y la ADN ligasa empalma los fragmentos resultantes. De este modo, se repara el ADN en E.coli, que posee una tasa de error de 10-10.

Reparaciónpostreplicativa:

mecanismo de recombinación para reparar lesiones del ADN una vez acabada la replicación. La cadena molde va a rellenar el hueco dejado por el no reconocimiento por la ADN polimerasa del dímero de T. Se produce una invasión de la cadena molde 3’-5’ mediante lisis del esqueleto azúcar-fosfato de forma que aparee con el molde 5’-3’, se va desplazando aguas arriba y se va produciendo nuevos cortes dando un hueco en ambas moléculas, estos serán rellenados por el ADN polimerasa y la replicación puede continuar, pero manteniendo el dímero de Timina en la hebra 5’-3’. 

Replicación SOS:

respuesta de emergencia en E.coli para impedir la muerte. En la molécula de ADN parental se encuentra la lesión, el ADNpol se descuelga al llegar a la lesión y continua la replicación más adelante: permite replicar la zona lesionada, añadiendo nucleótidos en el hueco dejado por la ADNpol III. Al descolgarse, la sustituye la ADNpol V que es de reparación y poco específica, en frente de la lesión añade 2 nucleótidos al azar continuando la replicación, pero a costa de producirse más mutaciones.

Proteína p53: guardián del genoma:

factor transcripcional supresor de tumores. El gen que lo codifica está mutado en 1 de cada 2 células cancerosas que acaban formando tumores. El P53 es muy importante en el ciclo celular ya que regula loscheckpoints G1/S y S/G2. G1/S: para determinar si el ADN está intacto, sin mutaciones. S/G2: permite pausar el ciclo antes del inicio de la mitosis, y se comprueba si el ADN está intacto.Activa y regula genes que detienen el ciclo celular para que otros genes se activen y comiencen a reparar el ADN. La proteína p53 puede poner en proceso el mecanismo de apoptosis, evitando que continúe y desarrolle mutaciones = muerte celular, el núcleo que condensa y se produce autolisis por rotura de los propios lisosomas.

TEMA 15.

Fenogénesis

Se trata de la expresión génica, la información genética hereditaria contenida en la secuencia de bases del ADN. Se transcribe a moléculas de ARNm, las cuales serán traducidas a proteínas por ribosomas. Un ARNm codifica para un aminoácido. Un gen es una unidad de información hereditaria, que codifica para una determinada cadena polipeptídica. Un gen es la secuencia de bases que contiene la información para la síntesis de proteínas (Watson y Crick).

Desarrollo histórico: enfermedades metabólicas humanas

Garrod estudió la alcaptonuria: enfermedad hereditaria por error innato del metabolismo debido al bloqueo de la enzima homogentísico oxidasa: ácido homogentísimo -> ácido maleilacetoacético; sin ella el pis es oscuro. Se observó genealogías de familias con esta enfermedad e hipotetizó: individuos sanos debían poseer algún compuesto = fermento o enzima, que los individuos afectados no poseían. Concluyó que el factor hereditario responsable de la enfermedad estaría relacionado con la falta de fermento necesario. Se vio que estaba relacionado con el metabolismo de proteínas en aquellas ricas en Phe y Tyr. La fenilcetonuria es una enfermedad genética que produce un bloqueo en la transformación de Phe en Tyr por déficit de la fenilalanina hidroxilasa, y el Phe se acumula en forma de fenilpirúvico que produce alteraciones en el sistema nervioso desencadenando un retraso cognitivo. Parte de la Tyr sintetizada va a la síntesis de 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) por acción de la tirosinasa.

El albinismo es una enfermedad genética por la cual el gen que codifica para la tirosinasa se encuentra mutado afectando a la pigmentación de la piel y demás. La Tyr se emplea en la síntesis de un metabolito intermedio que es el ácido p-hidroxifenilpirúvico, que es transformado por la p-hidroxifenilpirúvico oxidasa en el ácido homogentísico. La tirosinemia supone que el gen que codifica para la enzima que realiza la primera transformación esté mutado y exista un déficit de tirosina transaminasa, y este se acumule con graves consecuencias en los tejidos, dañándolos: se aumenta la probabilidad de padecer cáncer hepático. Por último, la alcaptonuria produciría un déficit en la homogentísica oxidasa, produciendo la acumulación de este y la pigmentación oscura de la orina y el tejido cartilaginoso.

Experimentos de Beable y Tatum. Teoría de “un gen-una enzima”

George Beadle y Edward Tatum trabajaron con el hongo Neurosporacrassa, que puede crecer en un medio mínimo. Irradiaron sus esporas con rayos X para inducir mutaciones y luego cultivaron esporas normales y mutadas en distintos medios (completo y mínimo). Observaron que las esporas mutadas no crecían en el medio mínimo, lo que indicó la aparición de mutantes auxótrofos (incapaces de sintetizar algún nutriente esencial). Para identificar qué compuesto faltaba, cultivaron las esporas en medios mínimos suplementados con vitaminas, bases o aminoácidos. Solo crecían en los medios con aminoácidos, lo que sugería una deficiencia en la síntesis de alguno de ellos
. Al probar medios con un solo aminoácido, descubrieron que los mutantes solo crecían con tirosina (Tyr)
, indicando que la mutación afectaba la producción de este aminoácido (mutantes tyr⁻). Análisis bioquímicos posteriores demostraron que estos mutantes carecían de una enzima necesaria para la síntesis de Tyr. Esto llevó a formular la teoría un gen-una enzima, que postulaba que cada gen codifica una enzima específica.Más adelante, la teoría evoluciónó a un gen-una proteína, al descubrirse que los genes también codifican proteínas no enzimáticas. Actualmente, la versión aceptada es la teoría un gen-una cadena polipeptídica, ya que muchas proteínas están formadas por varias cadenas codificadas por distintos genes.

Relación gen-proteínas: principio de colinealidad

Srb y Horowitz estudiaron mutantes de Neurosporacrassa auxótrofos para arginina (Arg), obtenidos por irradiación con rayos X. Cultivaron estos mutantes en diferentes medios: completo, mínimo, y mínimo suplementado con arginina, citrulina u ornitina. Observaron que: – Algunos mutantes solo crecían con arginina. – Otros crecían con arginina o citrulina. – Otros crecían con cualquiera de los tres compuestos.

Esto les permitíó deducir que la síntesis de arginina ocurre en una ruta metabólica lineal (ornitina → citrulina → arginina), y que cada mutación afectaba una enzima distinta de esa vía.Con estos descubrimientos, Francis Crick propuso el principio de colinealidad, que afirma que la secuencia de nucleótidos de un gen determina la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente.  Este principio fue confirmado en procariotas por Yanofsky en los años 60 mediante el estudio de mutantes del gen trpA de Escherichiacoli, observando que las mutaciones en el ADN correspondían directamente con cambios en la proteína, lo que permitíó construir mapas genéticos colineales.Sin embargo, en eucariotas este principio no se cumple completamente debido a la presencia de intrones. El ARNm maduro se forma tras eliminar estas regiones no codificantes, lo que rompe la correspondencia directa entre la secuencia del gen y la proteína final. 

TEMA 16.

Transcripción

Es el proceso de expresión de la información genética codificada en el ADN a través de un ARNm para dar proteínas mediante la traducción en ribosomas. A partir de una de las dos hebras de ADN de un gen se sintetiza ARNm complementario a la hebra molde por el proceso de transcripción. El ARNm presenta una serie de tripletes de ribonucleótidos = codones que son leídos por el ribosoma en la traducción y supone la adición de un aminoácido determinado a la cadena de aminoácidos que formarán la proteína.

Dogma central de la biología molecular

El ADN se replica mediante ADN polimerasas y se transcribía a ARNm mediante ARN polimerasas. Después es traducido en los ribosomas a proteínas.

Excepciones del dogma:

– transcriptasa inversa: sintetiza ADN a partir de ARN. – Replicasa de ARN: virus con material genético de ARN generan ARN complementario. – Priones: proteínas con capacidad de autorreplicación.

Evidencias de que el ARN es intermediario del ADN y proteínas:

– ADN forma cromosomas en el núcleo de eucariotas, pero las proteínas se sintetizan en el citoplasma, debe salir en forma de ARN. – El ARN se sintetiza dentro del núcleo de eucariotas. – La mayor parte del ARN eucariota migra al citoplasma. – En una célula la cantidad de ARN es proporcional a la de la proteína
.

Pruebas de estas conclusiones:

•Volkin

• Jacob y Monod (1961): el ARNm es fabricado sobre un molde de ADN y dirige la síntesis de proteínasespecíficas en asociación con los ribosomas. • 1970 se observó con microscopía electrónica la transcripción: Miller observó una estructura en forma de árbol navideño que corresponda con el proceso de transcripción. La transcripción se producía desde la punta hasta la base y se determinó que el eje central era el ADN ya que al ser tratado con ADNasas desaparecía. Y las ramas eran el ARNm.

El ARNm: complementariedad de bases con el ADN molde

En la transcripción solo se sintetiza ARN complementario a una de las dos cadenas del ADN (Marmur). La otra cadena es no molde o acompañante. La síntesis es complementaria y antiparalela a la cadena molde (síntesis 5’->3’; lectura 3’->5’), el ARN sintetizado es igual a la cadena no molde pero con U en lugar de T. Experimento de Marmur: demostró que solo una cadena se transcribe. Infección de Bacillussubtilis por el fago SP8 en un medio con precursores radiactivos ARN. El fago infecta la bacteria y comienza su ciclo de forma que los ARN marcados radiactivamente serán del fago. Por otro lado, se hicieron cultivo de SP8 apareciendo muchos virones y extrajeron el ADN del fago descubriendo que hay una cadena con más bases púricas (cadena pesada) y otra con más bases pirimidínicas (cadena ligera C-T). Se extraen las cadenas simplexas (centrifugación). Las pusieron en contacto con con ARN radiactivo en condiciones para la renaturalización, hibridando solo en cadenas pesadas púricas de ADN.El ARN procedía de las cadenas pesadas de ADN, la transcripción ocurría a partir de una de las dos cadenas de ADN. Lo normal es que ambas cadenas puedan ser moldes en distintos genes, así, un gen tiene una determinada cadena molde y otro gen pues otra.

Conclusiones de la transcripción

:  • Transcripción: procedo por el cual se sintetiza ARN sobre un molde de ADN dando una molécula de ARNm complementaria a su cadena molde de ADN. • Durante la transcripción solose emplea pequeñas porciones de la molécula de ADN que corresponderían a un gen o como mucho algunos pocos.
En procariotas, un ARNm tiene información para sintetizar varias cadenas polipeptídicas = ARNm policistrónico.
En eucariotas, tan solo codifica para una cadena polipeptídica = ARNm monocistrónico. • Solo se transcribe una cadena de las dos del ADN, la hebra molde. • La transcripción es un proceso altamente selectivo: solo se transcribe cuando se requieran sus productos.

Proceso de transcripción general.Unidad de transcripción:

secuencia de ADN a partir del cual se va a originar la transcripción. Incluye: promotor, regíón codificadora de ARN y un terminador. ADN promotor:secuencia que es reconocida por el ARN polimerasa marcando el inicio

Regíón de codificación: aquella cadena de ADN que sirve de molde justo después del promotor y que es complementaria al ARNm. Secuencia terminadora: contiene una serie de señales que indican el fin del proceso.

ARN polimerasas:

el sustrato que emplea son los ribonucleótidos trifosfatos (rNTP) que se unen entre sí por enlace 3,5-fosfodiester en sentido 5’->3’ formando la cadena siguiendo la cadena molde del ADN.
No es necesario el cebador ya que las ARN pol pueden sintetizar sin necesitar un cebador. El ARN sintetizado presenta un ribonucleótido trifosfato en el extremo 5’, pero el resto de nucleótidos quedan como monofosfatos ya que se libera un pirofosfato por hidrólisis liberando energía necesaria para la polimerización.

ARN pol en procariotas:

participa en la síntesis de todos los tipos de ARN bacteriano: ARNt, ARNm, ARNr.Tiene dos partes bien definidas: • El factor sigma, σ = holoenzima: se une al núcleo de la ARN polactivando la enzima. En E. coli el σ70 es responsable de la transcripción de la mayoría de los genes en condiciones normales. Existen muchos más tipos. • Un núcleo o core = apoenzima:parte de la enzima que está inactivada hasta que se une el factor sigma.

ARN polimerasa en eucariotas:

ARN pol I: presente en todos los eucariotas, se encarga de ARNr grandes. ARN pol II: en todos los eucariotas, sintetiza ARHhn, ARNnp, ARNpno, micro-ARN. ARN pol III: en todos, sintetiza ARNt, ARNr pequeños, ARNnp, micro-ARN. ARN po IV: en plantas, sintetiza ARNpi. ARN pol V:  en plantas, sintetiza ARN para formación de heterocromatina.

INICIACIÓN transcripción en procariotas

(A) Reconocimiento del promotor. Factor sigma,unido al núcleo del ARN pol, reconoce el ADN-promotor produciendo la uníón del ARN pol a la cadena molde ADN. La secuencia promotora se encuentra en cis (en la misma cadena) respecto a la regíón codificadora de ARN. Las secuencias consenso de promotores se encuentran aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción: caja TATA:  -10, comienza a separarse las hebras por ser menos inestables (2 enlaces de H)yCaja –35, ambos separados por 16-18 pb (90% de los promotores). Existe una tercera secuencia consenso, elemento UP: rico en A-T, a 40-60 pb aguas arriba, se encuentra en promotores de genes expresados con alta frecuencia (genes de ARNr). (B) Formación de la burbuja de transcripción y creación de los primeros enlaces. Factor sigma = holoenzima llega a caja TATA –10 empieza el separado de las hebras. Un nucleótido trifosfato del ADN en el sitio de iniciación se utiliza para iniciar la molécula de ARN, a partir de este se van uniendo más nucleótidos trifosfatos de ARN complementarios a la hebra molde uníéndose entre sí por enlaces 3-5-fosfodiester liberando un pirofosfato dando la energía requerida para la polimerización.

(C) Salida del aparato transcripción del promotor. Tras moverse unos nucleótidos aguas abajo del promotor, se desprende el factor sigma del ARN pol dando un cambio conformacional permitiendo continuar con la transcripción.

ELONGACIÓN de la transcripción en procariotas:

ARN pol se libera del promotor y avanza hacia 3’. Va desenrollando el ADN hacia 3’ y lo enrollando aguas arriba de la burbuja de transcripción. La molécula de ARN va a seguir formándose por polimerización de ribonucleótidos de ADN complementarios a la cadena molde del ADN, formando un heterodúplex temporal:
híbrido de ADN y ARN de 8-10 nucleótidos.

TERMINACIÓN de la transcripción en procariotas:

fundamental las secuencias terminadoras, que también son transcritas: • Terminadores independientes de ρ (intrínsecos): secuencias repetitivas invertidas en ambas cadenas en el ADN terminador. Las secuencias transcritas complementarias forman una horquilla = lazo que retiene a la ARN pol que finalmente transcribirá una secuencia de UUUUUUU que al ser muy inestable descuelga el ARN pol finalizando la transcripción. • Terminadores dependientes de la proteína ρ: la proteína ρ se une a secuencias del ARN y va a desplazarse en dirección a la ARN pol hacia el extremo 3’. La alcanzará cuando la ARN pol es retenida por el lazo de la secuencia terminadora, se unen y por la actividad helicasa de la proteína ρ, el ARN es separado del ADN finalizando del todo la transcripción.

Diferencias entre la transcripción de procariotas y eucariotas. Carácter policistrónico:

• En eucariotas la transcripción es en el núcleo. • Los eucariotas presentan hasta 3 tipos de ARN pol para diferentes ARN. • En procariotas hay un acoplamiento entre transcripción y traducción. • En eucariotas no hay factor sigma, se necesita la uníón previa de proteínas a distintos elementos del promotor para la uníón de la ARN pol. • La transcripción es más rápida en eucariontes.

Diferencias a nivel estrucural

: • el ARNm de eucariotas necesita un proceso de maduración previo a la síntesis de proteínas. (no maduración en procariotas) • ARNm de eucariontes esmonocistrónico, solo codifica para una única cadena polipeptídica.

INICIACIÓN de transcripción en eucariotas:

el ARN pol reconoce al ADN promotor y se inicia la polimerización de ribonucleótidos. Secuencias de ADN (en cis): • promotores: reconocidas por la ARN pol II, determina un gen para transcribir. • Intensificadores o represores: secuencias de ADN a las que se van a unir ciertas proteínas, regulando la actividad transcriptora del gen. Proteínas accesorias (en trans): • Factores de transcripción general: proteínas imprescindibles para que comience el proceso de transcripción. • Proteínas reguladoras de la transcripción:son activadoras o represoras,se unen a secuencias del ADN o a otr 

Elementos de iniciación:

el promotor mínimo es el conjunto de componentes de un promotor que aparecen siempre. El promotor abarca la secuencia promotora regulativamuy variable y se forma por combinación de distintas secuencias consenso y se sitúa aguas arriba del promotor mínimo. Secuencias consenso del promotor mínimo
: • Elemento reconocedor de TFII-B: rica en G y C, muy estable, -35 del sitio de iniciación. • Caja TATA: rica en T-A, poco estable, permite que las hebras comiencen a separarse. Su proximidad a la regíón codificadora de ARN determina también la posición del sitio de iniciación. • Elemento iniciador (Inr): sitio de uníón de la transcripción, abarcando secuencias aguas arriba y abajo de este. La secuencia consenso es variable. • Elementos iniciador DPE: muchos lo tienen.

Secuencias consenso del promotor regulativo

: • Caja CAAT, que aparece en los promotores de algunos genes en una única copia, dos copias. • Caja GC. • OCT (octámero), permiten la uníón de proteínas reguladoras del proceso de transcripción.

Elementos en cis: intensificadores:

secuencias de ADN que se encuentran lejos del gen tanto aguas arriba como abajo, el ADN forma un bucle que permite acercar el intensificador al promotor. A estos reguladores también se les pueden unir proteínas, que aceleran o bloqueen el proceso de transcripción.

Proteínas accesorias (trans):

van a iniciar, estimular o reprimir el proceso de transcripción. • Factores de transcripción general (TFIIX): proteínas necesarias para iniciar la síntesis de ARN, reconocen las secuencias consenso del promotor y reclutan a la ARN polimerasa
. Forman parte del aparato de transcripción basal junto con la polimerasa • Proteínas reguladoras (activadoras o represoras) de la transcripción: no se requieren para inicio, pero influyen en la tasa de transcripción.

INICIACIÓN eucariotas:

primero la caja TATA del promotor es reconocida por las proteínas de transcripción general TFII-D. Se une un conjunto de TFII a la ARN pol siendo la holoenzima que junto con una proteína mediadora se forma el aparato transcripcional
. TFII-H tiene actividad de helicasa y actividad de fosforilasa. Para aumentar la velocidad de transcripción se necesita el promotor regulativo y las secuencias consenso, a los que se les une las proteínas reguladoras que interaccionan con el aparato transcripcional de forma directo o indirecta (coactivador). Aguas arriba está el intensificador que cuando se pliega la cromatina permite que se aproxime al promotor y al interaccionar con el aparato de transcripción intensifica la velocidad.  

ELONGACIÓN de la transcripción en eucariotas:

Las diferentes ARN polimerasas tienen distintos promotores y distintos TF propios variando su comportamiento. ARN pol II: alto peso molecular, 12 subunidades, 2 grandes que forman abrazadera en cuyo surco se introduce el ADN. Al inicio del proceso tiene varios abortos 

s hasta que sintetiza un corto segmento de ARN y ya tira bien. En su sitio activo se dan los enlaces 3,5-fosfodiester de polimerización entre los ribonucleótidos trifosfatos. Al sintetizar unas 2 decenas de nucleótidos, finaliza la iniciación y se inicia la fase de elongación, para lo cual se debe liberar del promotor: la ARN pol se suelta del promotor al añadir el grupo fosfato por el TFII-H al extremo carboxilo de la subunidad mayor de la ARN pol II dando un cambio conformacional líberándose.

TERMINACIÓN de transcripción en eucariotas:

y dependiendo de qué ARN polimerasa esté transcribiendo, existe un factor de finalización distinto o no lo habrá. ADN directamente, que se desprende por la acción de una helicasa. En la transcripción del ARN heterogéneo nuclear (ARNhn), la terminación es marcada por ciertas secuencias terminadoras que son transcritas: señal de corte, que también es transcrita, pero indica el punto de corte de ese ARNhn por las endonucleasas. En el corte se forman dos trozos de ARN y la exonucleasa Rat que se une al extremo 5′ del ARN que se ha seguido transcribiendo y lo digiere a medida que avanza. Cuando alcanza la ARN pol II se termina la transcripción y la ARN pol II se descuelga.

TEMA 17.

Procesamiento de los productos de transcripción

ARNm y principio de colinealidad:

el principio de colinealidad sugiere que una secuencia continua de nucleótidos del ADN codifica una secuencia continua de aminoácidos de una proteína determinada (Crick 1958). El número de codones de ARNm es igual al número de aminoácidos, pero esto no se cumple en eucariotas.
La no colinealidad de los genes eucariotas fue descubierta al hibridar ADN con su ARNm correspondiente, existían secuencias que eran transcritas y luego no aparecían en el ARNm final. Estas secuencias son los intrones.

Conclusiones:

• Los intrones son comunes en los genes eucariotas y raros en los genes bacterianos. • El tamaño y número de intrones parece estar relacionado con la complejidad del organismo • El tamaño medio de los intrones es de unos 150pb • Los exones suelen tener un tamaño menor de 1kpb, y suelen constituir el 10% de la secuencia codificante. • La regíón que se transcribe de un gen puede llegar a medir hasta 2,5 Mpb. Descubrimiento por: hibridar ARNm eucariotas con secuencias de ADN (genes) de adenovirus (previa desnaturalización).

Los intrones: clasificación según el mecanismo de eliminación:

• Grupo I:
En algunos genes de ARNr y se eliminan por autoprocesamiento, se eliminan a sí mismos (autocorte y empalme). • Grupo II:
en genes que codifican proteínas en mitocondrias y cloroplastos, se eliminan por autocorte y empalme • Pre-ARNm nuclear (ARNhn):
En genes nucleares que codifican para proteínas. Se eliminan por corte gracias a los espliceosomas (realizan splicing) y empalme. • ARNt:
en genes que codifican para ARNt en eucariotas y arqueas. El corte mediante endonucleasas, y los exones son empalmados por ligasas. 

ARNm procariota:

• Hacia el extremo 5’, 5’ UTR, regíón 5’ no va a ser traducida. • Hacia el extremo 3’, 3’ UTR, regíón 3’ no va a ser traducida • Una regíón codificadora, que comienza con el codón de iniciación AUG, de la traducción y en procariotas codificaría para el aminoácido N-formilmetionina.
6 o 7 nucleótidos aguas arriba se encuentra la secuencia de Shine-Dalgarno, exclusiva de procariotas, y sirve para el reconocimiento por el ribosoma, complementaria a una regíón del ARNr de 16S, implica la uníón a esta. En eucariotas existe la secuencia de Kozak, que no es una secuencia consenso como la de Shine-Dalgarno, se encuentra en algunos ARNm alrededor del sitio de inicio de la traducción facilitando el posicionamiento del ARNm, pero no implica uníón con el ARNr. • En eucariotas, por tanto, los ribosomas reconocen la caperuza 5’ del ARNm.
• En eucariotas, el codón AUG codifica para Met (al igual que en arqueas). • También, en el ARNm eucariótico se eliminan los intrones en la maduración a partir del ARNhn, y también se le añade en el extremo 3’ una cola de poli A.
Diferencia funcional: – transcripción y la traducción en procariotas están acopladas, se debe a la ausencia de envoltura nuclear: todo ocurre en el citosol. Esto supone que el ARNm sea reconocido por la subunidad menor del ribosoma por la secuencia de Shine-Dalgarno y se inicie la traducción: a medida que las subunidades ribosómicas van avanzando por el ARNm, se va dejando libre esta secuencia, lo que supone que se une la subunidad menor de otro ribosoma y se traduzca varias veces a la vez. De esta forma, se forma una estructura consistente en el ARNm con múltiples ribosomas pasando por él = polisoma, y también se aprecia en eucariotas.

Procesamiento del ARNm en eucariotas

(A) Adición de la caperuza en el extremo 5’:

ocurre después de la iniciación de la transcripción y consiste en la adición de una guanosina en el extremo 5’ del ARNhn, con posterior metilación de este en posición 7, se va a producir una modificación en los azúcares de nucleótidos en el extremo 5’. Se transcribe el ARNhn y se va a hidrolizar uno de los 3 fosfatos presentes en el extremo 5’, del primer nucleótido por la fosfohidrolasa, se añade una guanosina monofosfato al extremo 5’ invertida formando un enlace 5’,5’- fosfodiéster (guanidil transferasa). Se añade un grupo metilo en posición 7 de esta guanosina y otros nucleótidos. 

Esta caperuza 5’ va a ser reconocida por el ribosoma para la entrada en el proceso de traducción. .

(B) Adición de la cola de poli A al extremo 3’:

se realiza una vez transcrito. Existe un sitio de corte que es hidrolizado y es donde se añade la cola de poliA = adenosinas de entre 50 y 250 bases. El sitio de corte = secuencia consenso AAUAAA, indica que unos 20 o 30 bases aguas abajo está el sitio de corte. También hay más aguas abajo una secuencia repetitiva de U. La secuencia consenso marca el final de la transcripción y el sitio de corte por poliadenilosoma: • CPSF:
Factor específico de la poliadenilación por escisión que reconoce la secuencia consenso AAUAAA • CstF:
Factor estimulación del corte. Reconoce la secuencia de repetitiva de U • Endonucleasa con las subunidades CFI y CFII:
Factores de escisión • PAP o poliadenilato polimerasa • PBP proteína que se une al poli-A. La CstF va a realizar el corte en el ARNhn gracias a la uníón de CFI y CFII, y la PAP va a añadir en el fragmento de mayor tamaño la cola de poli-A en el extremo 3’ por adición a este extremo de ribonucleótidos de adenina. Asimismo, a medida que se va formando la cola de poli-A, esta va a ser estabilizada por la uníón de la proteína PABII (o PBP). Una vez se produce la elongación y terminación de la cola de poli-A, se tiene el extremo 3’ modificado.

Procesamiento del ARNm: SPLICING

El splicing lo realizan los espliceosomas, que son ribonucleoproteínas que hidrolizan los límites entre exones e intrones y empalman los intrones. Con proteínas asociadas, formando partículas ribonucleoproteínas pequeñas (snRNP o snurps), de las que hay 5 tipos: U1, U2, U4, U5 y U6, se debe a la riqueza en uracilo de sus secuencias de ARNpn. Los espliceosomas se unen por sitios específicos y cortan el ARNhn por los sitios de corte y empalme 5’ y 3’, y se encuentran entre todos los intrones con los exones adyacentes.

La mayoría de los intrones responde a la regla GU-AG

Asimismo, entre 18 y 40 bases aguas arriba de la secuencia consenso 3’ del intrón, se tiene una secuencia en la que existe una adenina, la cual va a ser fundamental en el splicing y se denomina punto de ramificación.
El splicing comienza, con la uníón de la U1 al sitio de corte y empalme 5’, ya que reconoce la secuencia consenso del extremo 5’. Después, la U2 se une al punto de ramificación y, a continuación, se unen el resto (U4, U5 y U6), formando un complejo , el espliceosoma

, se produciría el splicing: se hidrolizan los exones y se libera el intrón, que se degrada, mientras que los exones se unirían entre sí.  Para ello, se produce un plegamiento en el ARN desde el extremo 5’ hacia el punto de ramificación y se liberan U1 y U4, de forma que los dos sitios de corte y empalme y el punto de ramificación se encuentran próximos entre sí: El corte y empalme de dos exones del ARNm se da mediante dos reacciones de transesterificación, formando un Èster y un alcohol. De esta forma, el grupo -OH del carbono 2’ del punto de ramificación va a atacar al enlace 3’,5’-fosfodiÈster del sitio de corte y empalme 5’, produciendo la liberación del primer exón y formando un lazo en el intrón.
Posteriormente, el alcohol que ataca al enlace fosfodiéster para producir la transesterificación sería el extremo 3’-OH que se habría formado al liberarse el primer exón, y este atacaría a este enlace en el punto de corte y empalme 3’, formando ambos exones el enlace 3’,5’-fosfodiÈster típico.
De esta forma, el intrón sería liberado de los exones y se separaría de las snurp para su degradación. Por otro lado, los exones quedarían unidos entre sí.

Excepciones del Splicing del ARNhn: autocorte y empalme. Vías alternativas

(A) Proceso de autocorte y empalme de los intrones del grupo I:

existen otros ARN que eliminan sus intrones por autocorte y empalme. Intrones del grupo I de ARNr, se van a autoprocesar, la propia molécula de ARN va a eliminar los intrones de su estructura. En un ARN con un intrón del grupo I se tienen muchas estructuras de tallo-lazo por apareamientos intracatenarios en la molécula de ARN, lo que facilita el proceso de autoprocesado: se tienen dos exones separados por un intrón gigantesco. Un ribonucleótido de guanina llega a la molécula de ARN y va a atacar el enlace 3’,5’-fosfodiÈster del sitio de corte y empalme 5’ (transesterificación
)
, de forma que el nucleótido se une al extremo 5’ del intrón y el exón 1 es liberado, supone que aparezca un extremo 3’-OH en su estructura, por lo que ataca el enlace fosfodiéster del sitio de corte y empalme 3’, de forma que el intrón es liberado y los exones son empalmados entre sí. í.

(B) Mecanismos de autocorte y empalde de los intrones del grupo II:

en ARN codificados por genes de mitocondrias y cloroplastos de algunas especies, mecanismo es muy similar: se va a tener un intrón de gran tamaño que establece varias estructuras de tallo-lazo por apareamientos intracatenarios. 

El extremo 2’-OH del nucleótido de adenina que forma el punto de ramificación en el intrón va a atacar el enlace fosfodiéster del sitio de corte y empalme 5’ (transesterificación),  , dando lugar a un lazo y a la liberación del primer exón, que ataca el enlace 3’,5’- fosfodiéster en el sitio de corte y empalme 3’, dando lugar a la liberación del intrón y la uníón de ambos exones.

SPLICING alternativo. Corte y empalme alternativo

se puede dar cuando un ARNhn presenta más de dos exones en su estructura o cuando solamente hay un intrón, pero se tienen varios puntos de corte del ARN en el gen.

(A) Splicing alternativo en ARNhn con varios intrones:

el cual da lugar a un ARNm distinto (y por ello, a una cadena polipeptÌdica distinta) que si se sigue el splicing común. El splicing alternativo supone que se eliminen ambos intrones y el exón entre ambos (en lugar de eliminarse los intrones únicamente y empalmarse los 3 exones entre sí), por lo que aparece una molécula diferente de ARNm diferente de la que debería ser en principio. El mecanismo de splicing está regulado genéticamente: por tipos celulares, aunque también pueden aparecer 2 o 3 mecanismos en el mismo tipo celular.

(B) Splicing alternativo en ARNhn por un gen con varios puntos de corte:

en un mismo gen pueden existir varios puntos de corte diferentes, dando lugar a moléculas de heterogéneo nuclear diferentes que codifican para diferentes cadenas polipeptídicas, en función de donde se encuentre el corte. Estas diferencias se dan por expresión génica diferencial. Por ello, el ARNhn puede ser cortado más aguas arriba o más aguas abajo dependiendo del sitio de corte, aunque un mismo tipo celular puede producir los dos tipos de ARNhn, codificando para dos cadenas polipeptídicas diferentes. Ejemplo: gen de la calcitonina.

Mecanismo de edición del ARNm mediado por ARN guías y enzimas:

Una vez formado el ARNm maduro, se puede editar por cambios en su secuencia de nucleótidos. Uno de los mecanismos por los que esto ocurre es mediante un ARN guía (ARNg), ARN procedente de la transcripción de otro gen y con una secuencia muy parecida a la secuencia complementaria del ARNm maduro, pero no es del todo complementaria, por lo que aparecen lazos en esta cuando aparea con el ARNm, donde se producen hidrólisis del esqueleto azúcar-fosfato del ARNm, por lo que el ARNg se estira como consecuencia. 

En el ARNm quedan huecos, por lo que son rellenadas con nucleótidos por el ARNg como hebra molde. Esta edición del ARNm ocurre en casos excepcionales, pues lo normal es que los exones se empalmen entre sí y quede listo para la traducción en los ribosomas.
La edición del ARNm se produce, por ejemplo, en los enterocitos, en el ARNm que codifica para la apolipoproteína B100, que está implicada en el transporte de colesterol. En el ARNm existe un codón que codifica para Gln (CAA), la citosina se va a desaminar, formando uracilo. De esta forma, se forma un codón UAA, que es un codón de parada, por lo que en su traducción en los ribosomas va a dar lugar a un péptido truncado, que es la apolipoproteÌna B48 Y POR ESO SE EDITA.