Fundamentos de la Espectrofotometría UV-Vis

Relación entre Leyes de Absorción

La Ley de Lambert se relaciona con la longitud del medio absorbente (el camino óptico). Esta ley ha quedado parcialmente obsoleta en la práctica moderna debido a que la longitud de la cubeta se ha estandarizado.

La Ley de Beer se enfoca en la concentración del medio absorbente, donde se encuentra el compuesto que absorbe la radiación.

Absorbancia y Transmitancia

La absorbancia y la transmitancia no son lo mismo; representan la medición desde puntos de vista distintos:

• Transmitancia (T): Es la fracción de luz incidente que atraviesa la muestra. Se expresa a menudo como porcentaje (T = (I/I₀) × 100%). Solo se utiliza para medir materiales aislantes.
• Absorbancia (A): Es la cantidad de radiación de un haz que ha sido atenuado al pasar por un medio absorbente, en función de la longitud del camino óptico y la concentración del medio.

La relación matemática fundamental es:

$$A = a \cdot l \cdot c \quad \text{o} \quad A = \varepsilon \cdot l \cdot c$$

Donde:

• $a$ o $\varepsilon$ es la Absortividad Molar (constante de proporcionalidad que describe qué tan intensamente absorbe la luz el compuesto a una longitud de onda específica, función de sus características intrínsecas).
• $l$ es la longitud del camino óptico (largo de la cubeta).
• $c$ es la concentración del compuesto.

La aplicación principal de esta ley es la cuantificación de elementos en una solución.

Limitaciones de la Ley de Beer

La Ley de Beer es útil, pero su validez es limitada. Se basa en que la absorbancia aumenta proporcionalmente con la concentración. Sin embargo, este razonamiento solo es válido hasta cierto rango lineal. Cuando el elemento está demasiado concentrado, la relación deja de ser lineal y proporcional debido a:

• Interacciones moleculares excesivas entre el soluto y el solvente.
• La necesidad de que las moléculas del soluto estén suficientemente separadas para que los rayos de luz pasen sin interferencia mutua.

Nota importante: Las mediciones deben realizarse siempre a la longitud de onda máxima ($\lambda_{máx}$).

Fuentes de Error y Desviaciones de la Linealidad

Las desviaciones de la linealidad pueden deberse a varios factores:

• Desviación química: Cuando el analito se disocia, se asocia o reacciona con el solvente.
• Radiación parásita: Luz externa que se infiltra, pasa por el monocromador y llega a los detectores, disminuyendo la linealidad.
• Celdas de muestra desajustadas.

Componentes del Espectrofotómetro (UV-VIS)

Un Espectrofotómetro es la combinación de un Espectrómetro y un Fotómetro:

• Espectrómetro: Produce, dispersa y detecta o mide la luz.
• Fotómetro: Mide la intensidad de esa luz para cuantificarla.

Calibración e Importancia en el Proceso Analítico

La calibración es esencial para cuantificar un método o un análisis, el cual se lleva a cabo bajo circunstancias específicas.

Pasos para Cuantificar un Analito

1. Selección del método.
2. Toma de la muestra.
3. Preparación de la muestra (siguiendo protocolos específicos).
4. Dilución de la muestra.
5. Cambio de forma química (si es necesario).
6. Eliminación de interferencias.
7. Medición.
8. Cálculo de resultados (considerando factores previos como la selección de $\lambda$, variables influyentes, limpieza de celdas y la determinación de la relación absorbancia-concentración).
9. Interpretación.

Definición de Calibración

La calibración es el conjunto de operaciones que busca establecer una relación entre la señal medida por el equipo (instrumento o método) y un valor considerado verdadero, proporcionado por un estándar.

Tipos de Patrones o Estándares

• Patrones básicos: Los más perfectos (ej. kilogramo, mol, metro).
• Estándar químico: Vínculo entre patrones básicos y analíticos (ej. número de Avogadro, pesos atómicos).
• Estándares analíticos: Sustancias homogéneas que relacionan la concentración de interés con la señal del equipo (ej. material de referencia certificado para glucosa, colesterol).

Calibración de Instrumentos vs. Calibración de Métodos

Calibración de Instrumentos (Equipos):

• Objetivo: Comprobar el correcto funcionamiento y corregir la respuesta instrumental.
• La magnitud medida es la misma que la del patrón.
• El patrón no contiene el analito.
• Ejemplo: Comparación directa (pHmetro, balanza, espectrofotómetro).

Calibración de Métodos Instrumentales:

• Objetivo: Caracterizar la respuesta, estableciendo la relación entre la señal y una propiedad del analito.
• La magnitud medida es distinta a la magnitud conocida del patrón.
• El patrón contiene el analito.

Calibración con Estándar Externo (Simple o Directa)

Se basa en construir una curva de calibración utilizando un estándar que contiene el analito, preparado y analizado por separado de la muestra problema.

• Procedimiento: Se preparan diluciones seriadas del estándar de concentraciones conocidas y se mide su señal, relacionando concentración y señal.
• Ventajas: Rápido, simple, económico y práctico.
• Desventajas: Asume que la respuesta del instrumento es idéntica para el estándar y la muestra, lo que puede generar incertidumbre por contaminaciones o errores en la preparación de blancos y patrones.

Importancia de Calibrar Instrumentos y Métodos

• Ajustar y comprobar las mediciones para asegurar que los resultados sean lo más cercanos posible a la verdad.
• Producir información analítica fidedigna.
• Es necesario calibrar periódicamente.
• El control de calidad (realizar mediciones de comprobación) es fundamental para detectar errores o desviaciones.

Señal y Ruido (S/R)

Señal (S): Corresponde a la información relativa al analito (la información de interés).

Ruido (N): Corresponde a información no deseada que degrada la exactitud y precisión. Es una señal imprecisa y aleatoria que aumenta el límite inferior de detección.

Relación Señal/Ruido (S/R)

Es la proporción entre la potencia de la señal y la potencia del ruido que la corrompe. Cuantifica la calidad del instrumento para análisis específicos.

Efecto del ruido: Normalmente es constante e independiente de la señal, pero imposible de evitar. Su efecto aumenta a medida que la cantidad medida disminuye.

Tipos de Ruido

1. Ruido Químico: Surge de variables incontrolables que afectan las características químicas:
   • Temperatura (afecta equilibrios y densidades).
   • Presión.
   • Humedad.
   • Vibraciones.
   • Cambios en la intensidad de luz (para compuestos fotosensibles).
   • Vapores de laboratorio.
2. Ruido Instrumental: Relacionado con cada componente del instrumento (complejo e inevitable):
   • Ruido térmico de Johnson (fluctuaciones de voltaje).
   • Ruido de Disparo (paso de fotones).
   • Ruido fluctuante (depende de la frecuencia/longitud de onda).
   • Ruido ambiental (radiación electromagnética cercana).

Espectrofotometría y su Aplicación

Conceptos Estructurales y Espectrales

• Cromóforos: Grupos funcionales con electrones de enlace capaces de sufrir transiciones electrónicas que absorben radiación en el espectro UV-VIS (200 – 700 nm).
• Auxocromos: Grupos funcionales que sustituyen al cromóforo y alteran la $\lambda_{máx}$ y/o la $\varepsilon$ (Absortividad Molar).
• Efecto de Conjugación: La conjugación entre dos o más cromóforos tiende a desplazar la $\lambda_{máx}$ hacia el rojo (mayor longitud de onda).
• Espectro de absorción: Representación gráfica de la energía absorbida por la especie química en función de la longitud de onda. Las posiciones de los máximos de absorción son afectadas por la naturaleza del solvente.

Análisis Cuantitativo mediante Medición de Absorción

Este método se aplica ampliamente debido a:

1. Gran aplicabilidad (sistemas orgánicos e inorgánicos).
2. Límites de detección de $10^{-4}$ a $10^{-5}$ M.
3. Selectividad de moderada a alta.
4. Buena exactitud (incertidumbre de 1 – 3% o menos).
5. Fácil obtención de datos.

Aplicaciones en Especies Absorbentes

Son especies químicas que ya absorben radiación en el rango UV-VIS ($\varepsilon$ relativamente alta) sin necesidad de una reacción química previa. Ejemplo: Para-nitrofenol (4-nitrofenol).

Aplicaciones en Especies NO Absorbentes

Estas especies no absorben radiación en el rango UV-VIS por sí mismas. Requieren una transformación química con un reactivo para generar productos con alto $\varepsilon$ en UV-VIS.

• El producto resultante debe tener una Absortividad Molar ($\varepsilon$) órdenes de magnitud superior.
• La reacción debe ser completa o representativa para que el producto refleje la concentración del analito original.
• Sirve para moléculas e iones metálicos.

Consideraciones Previas al Análisis

El primer paso es establecer condiciones de trabajo que generen una relación lineal entre absorbancia y concentración.

Selección de Longitud de Onda

• Barrido espectral: Se recomienda usar la $\lambda$ con la mayor Absortividad Molar ($\varepsilon$), es decir, la $\lambda$ del pico.
• En esta $\lambda$, la relación absorbancia/concentración es más lineal y confiable, cumpliendo mejor la Ley de Lambert-Beer.
• Las incertidumbres y el ruido son menos influyentes en la $\lambda_{máx}$.

Variables que Influyen en la Absorbancia

• Naturaleza del solvente: Usualmente un buffer disuelto en agua a un pH conveniente.
• pH: Debe ajustarse para obtener la mezcla de especies iónicas que proporcione la $\lambda$ con mayor $\varepsilon$.
• Temperatura: A mayor temperatura, la solución es menos densa, lo que puede disminuir falsamente la absorbancia. En el caso de enzimas, a menor T°, el cambio de absorbancia por minuto ($\Delta \text{Abs}/\text{min}$) es menor.
• Alta concentración del analito: Puede requerir dilución para no sobrepasar el rango de linealidad.

Limpieza y Manipulación de Celdas (Cubetas)

• Deben estar siempre limpias, no ralladas ni desgastadas.
• Seguir estrictamente los protocolos de limpieza.

Determinación de la Relación Absorbancia y Concentración

El método de calibración con patrones externos es el más común por su practicidad.

• Se prepara la curva de calibración y se obtiene la ecuación de la recta.
• Es ideal que el estándar tenga una composición similar a la muestra (ej. si la muestra es suero, usar un suero sintético como estándar).

La ecuación obtenida permite interpolar o extrapolar la concentración de una muestra desconocida (del mismo analito y tras la misma transformación química) usando su absorbancia.

Tipos de Reacciones Químicas Medidas por Espectrofotometría

Fenómeno de Aparición y Desaparición de Cromóforo

A una $\lambda$ determinada, se observa la aparición o desaparición de un cromóforo. El ejemplo clásico es el NADH, que tiene $\lambda_{máx}$ a 339 nm y 259 nm, y se usa para evaluar reacciones enzimáticas acopladas a la oxidación/reducción NADH/NAD+.

Reacciones de Punto Final

Son transformaciones químicas de especies NO absorbentes donde la reacción se detiene, cesando la formación del cromóforo.

• La cantidad de cromóforo formado es proporcional a la cantidad inicial de analito NO absorbente.
• También puede ser una reacción de precipitación que genera turbidez.
• Miden cantidades por volumen (ej. mg/dL o g/dL) o porcentajes (%).

Reacciones Cinéticas

Son transformaciones químicas donde la cantidad de enzima se mide indirectamente a través de la aparición o desaparición de un cromóforo que representa la actividad enzimática.

Reacciones de 2 Puntos (Cinéticas a 2 Puntos)

La velocidad de formación del cromóforo es proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

• Ejemplos: Creatinina, Urea, Sodio y Potasio fotométrico.
• Miden cantidades por volumen (mg/dL o g/dL).
• Son ideales para analizar analitos donde existen sustancias inespecíficas que reaccionan lentamente con el reactivo de detección, permitiendo valorar principalmente el analito de interés y minimizar las inespecificidades.

Análisis de Conceptos de Desempeño

• Límite de Detección (LD): Concentración mínima de analito que puede detectarse con un nivel de confianza aceptable (distinguible del ruido).
• Límite de Cuantificación (LC): Concentración mínima de analito que puede cuantificarse con un nivel de confianza aceptable.
• Sensibilidad: Capacidad del método o instrumento para diferenciar pequeñas diferencias en la concentración. Depende de la pendiente de la curva de calibración (mayor pendiente = mayor sensibilidad).
• Linealidad / Rango Válido de Medición / Rango Dinámico: Intervalo de concentración donde el método es aplicable. La Linealidad es la capacidad de producir resultados directamente proporcionales a la concentración.
• Robustez: Capacidad del método para no ser afectado por pequeños cambios deliberados en sus parámetros, indicando su confiabilidad en el uso normal.
• Selectividad: Grado de ausencia de interferencia debida a otras sustancias presentes en la matriz de la muestra.