Clonación Molecular: Técnicas in vivo

La clonación molecular in vivo implica una serie de pasos fundamentales para amplificar un fragmento de ADN de interés:

1. Manipulación del ADN: Consiste en insertar el fragmento de ADN que se quiere amplificar en un vector de clonación (generalmente un plásmido). Este proceso da como resultado un vector recombinante.
2. Introducción del vector recombinante: El vector recombinante se introduce en una célula viva hospedadora (por ejemplo, una bacteria como E. coli).
3. Selección y multiplicación: Se seleccionan y multiplican en cultivo aquellas células hospedadoras que han incorporado el ADN recombinante. Este cultivo se mantiene hasta alcanzar un número suficiente de células que permita el estudio posterior del fragmento de ADN.
4. Recuperación del fragmento amplificado: Finalmente, se recupera el fragmento de ADN amplificado de las células cultivadas.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Ventajas Generales de la PCR

• Ahorro de tiempo y automatización: Es un proceso rápido y fácilmente automatizable.
• Menor cantidad de muestra: Requiere cantidades mínimas de ADN inicial.
• Cuantificación de secuencias concretas: Permite, en algunas de sus variantes, cuantificar la cantidad de una secuencia específica.

PCR Estándar

Es un proceso enzimático catalizado por una ADN polimerasa que permite la amplificación exponencial de un fragmento específico de ADN. Implica la replicación in vitro de dicho fragmento en un único proceso, y el resultado se evalúa generalmente al finalizar la reacción (tiempo final).

Componentes de la PCR Estándar

Cebadores o Primers

Son oligonucleótidos monocatenarios (secuencias cortas de ADN) diseñados para ser complementarios a las regiones que flanquean el fragmento de ADN que se quiere amplificar. El cebador Forward (F) y el cebador Reverse (R) se unen a los extremos opuestos del fragmento diana, definiendo la región a amplificar, conocida como amplicón.

ADN Polimerasas Termoestables

Son enzimas aisladas de bacterias extremófilas (que prosperan en ambientes hostiles, como altas temperaturas). Estas polimerasas son capaces de mantener su actividad catalítica a temperaturas elevadas, necesarias durante los ciclos de PCR. Características clave:

• Actividad polimerasa óptima generalmente entre 70-75°C.
• Capacidad de mantener su actividad tras exposiciones prolongadas a temperaturas de desnaturalización (aproximadamente 95°C).
• Poseen actividad exonucleasa 5’→3′.
• La mayoría de las polimerasas estándar (como la Taq polimerasa) no poseen actividad exonucleasa 3’→5′ (correctora de pruebas), aunque algunas variantes modificadas o de alta fidelidad sí la tienen.

Mezcla de Reacción

Contiene los siguientes reactivos esenciales:

• Tampón (Buffer): Proporciona el ambiente iónico y pH óptimos (generalmente Tris con cloruro potásico, a un pH entre 8.3 y 9.0, y agua).
• Cloruro Magnésico (MgCl₂): Es un cofactor enzimático esencial, requerido por la ADN polimerasa termoestable para su correcto funcionamiento. Su concentración puede necesitar optimización.
• Desoxinucleótidos Trifosfato (dNTPs): Se deben añadir los cuatro tipos (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) que componen las moléculas de ADN. La ADN polimerasa los utiliza como sustrato para incorporarlos a las nuevas cadenas de ADN en crecimiento.
• ADN Molde: La muestra de ADN que contiene la secuencia diana que se desea amplificar.

Ciclo de PCR

Un ciclo de PCR consta de tres etapas principales que se repiten múltiples veces (típicamente 25-40 ciclos):

1. Desnaturalización: La temperatura se eleva a aproximadamente 94-98°C. A esta temperatura, la doble hebra de ADN molde se separa (desnaturaliza) en dos hebras monocatenarias.
2. Anillamiento o Hibridación (Annealing): La temperatura se disminuye (generalmente entre 50-65°C, aunque el texto original menciona 50-56°C). Esto permite la hibridación (unión) específica de los cebadores (primers) a sus secuencias complementarias en las hebras monocatenarias del ADN molde.
3. Elongación o Extensión (Extension/Polymerization): La temperatura se eleva a aproximadamente 72°C (temperatura óptima para la actividad de la Taq polimerasa u otra polimerasa termoestable). La polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN complementarias a las hebras molde, comenzando desde los cebadores.

Fases de la Reacción de Amplificación

Durante el transcurso de múltiples ciclos de PCR, la acumulación de producto sigue un patrón característico:

1. Fase Inicial o de Retraso (Lag Phase): Durante los primeros ciclos (aproximadamente los primeros 5-10 ciclos), la cantidad de producto de PCR es demasiado baja para ser detectada fácilmente.
2. Fase Exponencial: En esta fase (aproximadamente hasta los ciclos 20-30), hay una duplicación teórica del producto de PCR en cada ciclo. La cantidad de producto aumenta exponencialmente.
3. Fase de Meseta (Plateau): La amplificación se ralentiza significativamente o se detiene. Esto puede deberse al agotamiento de uno o más reactivos (como dNTPs o cebadores), a la inhibición por la acumulación de producto, o a la pérdida de actividad de la enzima.

Procedimiento General de la PCR

1. 1. Preparación de Muestras y Mezcla de Reacción

   • Ajuste del Volumen de Reacción: Se decide el volumen final de la reacción (por ejemplo, 20 µL, 25 µL o 50 µL). Se complementa con agua estéril libre de nucleasas.
   • Mezcla Maestra (Master Mix): Para evitar errores al pipetear volúmenes pequeños y asegurar la consistencia entre reacciones, se prepara una mezcla común (Master Mix) que contiene todos los componentes (tampón, dNTPs, MgCl₂, polimerasa, cebadores) excepto el ADN molde. Esta mezcla maestra se reparte luego entre los tubos de reacción, a los que se añadirá individualmente el ADN molde o los controles.
   • Controles:
     • Control Negativo (-): Contiene la mezcla maestra y agua (o ADN que se sabe que no contiene la secuencia diana) en lugar de la muestra de ADN molde. Sirve para detectar contaminación de los reactivos o del ambiente.
     • Control Positivo (+): Contiene la mezcla maestra y un ADN control que se sabe que contiene el fragmento a amplificar. Verifica que todos los componentes de la reacción funcionan correctamente y que las condiciones de la PCR son adecuadas.

2. 2. Programación del Termociclador

   Se programan los ciclos de Desnaturalización, Anillamiento y Elongación en un termociclador. Se especifican las temperaturas y los tiempos para cada etapa, así como el número total de ciclos. A menudo se incluye una desnaturalización inicial más larga antes del primer ciclo y una elongación final más larga después del último ciclo. Al finalizar, es común programar una incubación a 4°C por tiempo indefinido para preservar los productos y minimizar la actividad enzimática residual.

3. 3. Análisis de Productos Amplificados

   Los resultados de la PCR se visualizan comúnmente mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN amplificados se separan por tamaño al aplicar un campo eléctrico. Se utiliza un marcador de peso molecular (MPM) o escalera de ADN para estimar el tamaño de los fragmentos amplificados.

   • Una única banda del tamaño esperado en el carril de la muestra indica una amplificación correcta y específica.
   • En un ensayo válido, la muestra que contiene la diana y el control positivo deben mostrar la banda esperada. El control negativo (blanco) no debe mostrar ninguna banda; si lo hace, indica contaminación.

Variantes Destacadas de la PCR

PCR Anidada (Nested PCR)

Consiste en la realización de dos reacciones de PCR secuenciales. La segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera PCR. Se emplean dos pares de cebadores:

• Cebadores Externos: Usados en la primera ronda de PCR.
• Cebadores Internos: Usados en la segunda ronda de PCR, diseñados para hibridar dentro del fragmento amplificado por los cebadores externos.

Esta técnica aumenta significativamente la sensibilidad (permitiendo detectar cantidades mínimas de ADN diana) y la especificidad (reduciendo la probabilidad de amplificaciones no deseadas).

PCR Múltiplex (Multiplex PCR)

Permite la amplificación simultánea de varias secuencias diana diferentes en un mismo tubo y en una sola reacción de PCR. Para ello, se utilizan varios pares de cebadores, cada uno específico para una diana diferente. Consideraciones importantes para su diseño:

• Los cebadores de los diferentes pares no deben ser complementarios entre sí para evitar la formación de dímeros de cebadores e hibridaciones inespecíficas.
• Las temperaturas de anillamiento (T_m) de todos los pares de cebadores deben ser compatibles y permitir una amplificación eficiente de todas las dianas bajo las mismas condiciones cíclicas.
• Cada pareja de cebadores debe amplificar una única secuencia diana de forma específica.
• Los amplicones generados deben tener tamaños suficientemente diferentes para poder ser separados y diferenciados claramente mediante electroforesis en gel u otros métodos de detección.

RT-PCR (PCR con Transcriptasa Inversa)

Se utiliza para amplificar y analizar moléculas de ARNm. Dado que las ADN polimerasas termoestables convencionales utilizan ADN como molde, el proceso de RT-PCR consta de dos pasos principales (que pueden realizarse secuencialmente en uno o dos tubos):

1. Síntesis de ADNc (ADN complementario): El ARNm se transcribe a una hebra de ADN complementario (ADNc) mediante una enzima llamada transcriptasa inversa (o retrotranscriptasa).
2. Amplificación del ADNc: El ADNc generado se utiliza como molde para ser amplificado mediante una PCR convencional con una ADN polimerasa termoestable y cebadores específicos para la secuencia de interés.

PCR a Tiempo Real o Cuantitativa (qPCR)

La qPCR (también conocida como PCR cuantitativa) monitoriza el proceso de amplificación en tiempo real, ciclo a ciclo, mediante el uso de materiales fluorescentes. La detección de los productos de PCR (amplicones) se realiza a medida que se generan. Se lleva a cabo en un termociclador de tiempo real, que está equipado con un sistema óptico para excitar los fluoróforos en la reacción y un detector para medir la intensidad de la señal fluorescente emitida en cada tubo de reacción durante cada ciclo de la PCR.

Ventajas de la qPCR:

• Rapidez: Permite detectar y cuantificar una secuencia concreta más rápidamente que la PCR convencional seguida de análisis en gel.
• Resultados Fidedignos y Precisos: Ofrece resultados cuantitativos más precisos y reproducibles.
• Menor Riesgo de Contaminación: La amplificación y detección ocurren en el mismo tubo cerrado, minimizando la manipulación post-PCR y el riesgo de contaminación cruzada.
• Cuantificación: Permite cuantificar el número de amplicones producidos y, por ende, la cantidad inicial de ADN (o ARNm tras la RT) diana en la muestra.

Curva de Amplificación

Es una gráfica de forma sigmoide que representa la emisión de fluorescencia acumulada en función del número de ciclo. Consta de varias fases:

Fases de la Curva de Amplificación:

1. Zona de Ruido de Fondo (Baseline/Background): Al inicio de la reacción, el número de amplicones generados es insuficiente para que la señal fluorescente supere el ruido de fondo del instrumento y sea detectada.
2. Zona de Crecimiento Exponencial: La fluorescencia aumenta exponencialmente con cada ciclo, ya que los productos de PCR se duplican teóricamente en cada ciclo. Esta es la fase utilizada para la cuantificación. El ciclo en el que la señal fluorescente cruza un umbral de detección predefinido (threshold) se denomina Ct (Cycle threshold) o Cq (Quantification cycle). Cuanto menor es la cantidad inicial de secuencias diana en la muestra, más ciclos se necesitan para alcanzar este umbral (mayor Ct).
3. Zona de Meseta (Plateau): El rendimiento de la reacción disminuye drásticamente. El aumento de amplicones ya no es exponencial y la fluorescencia se estabiliza o incluso puede disminuir. Esto se debe al agotamiento de reactivos (dNTPs, cebadores), a la inhibición por acumulación de producto, o a la degradación de la enzima.

Cuantificación de la Muestra

Para cuantificar la concentración de ácido nucleico (AN) en una muestra desconocida (por ejemplo, de un paciente), se realiza una qPCR para la muestra y, simultáneamente, para una serie de diluciones de un patrón de concentración conocida (ADN o ARN). Se genera una curva estándar (o curva de calibración) graficando los valores de Ct de los patrones frente a sus concentraciones iniciales (generalmente en una escala logarítmica). El valor de Ct obtenido para la muestra desconocida se interpola en esta curva estándar para determinar su concentración inicial de ácido nucleico.

La cantidad de amplicón producido es directamente proporcional al número inicial de moléculas del ácido nucleico diana. Por lo tanto, en muestras con una mayor carga (por ejemplo, carga viral) o mayor cantidad de la secuencia diana, la señal fluorescente detectable aparecerá en ciclos más tempranos (es decir, el valor de Ct será más bajo).

Sistemas de Detección Fluorescente en qPCR

Para la detección en qPCR, se añade a la mezcla de reacción un sistema fluorescente que permite monitorizar la acumulación de amplicones:

1. Sistemas Independientes de Secuencia (Intercalantes)

Utilizan agentes fluorescentes intercalantes, como el SYBR Green I, que emiten fluorescencia al unirse inespecíficamente a cualquier molécula de ADN de doble cadena.

• Ventaja: Son sencillos de usar y relativamente económicos.
• Desventaja: Su principal problema es la baja especificidad, ya que también detectan productos de PCR inespecíficos y dímeros de cebadores. Se suele realizar un análisis de curva de fusión (melting curve) al final de la qPCR para verificar la especificidad del producto.

2. Sistemas Específicos de Secuencia (Sondas)

Utilizan sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica con una secuencia interna del amplicón (entre los sitios de unión de los cebadores). La generación de fluorescencia está directamente ligada a la hibridación con el producto de PCR deseado, lo que aumenta significativamente la especificidad de la detección. Ejemplos comunes incluyen:

• Sondas de Hidrólisis (ej. Sondas TaqMan®): Llevan un fluoróforo reporter y un quencher. Durante la elongación, la actividad exonucleasa 5′-3′ de la polimerasa degrada la sonda hibridada, separando el reporter del quencher y generando señal fluorescente.
• Balizas Moleculares (Molecular Beacons): Sondas con estructura en horquilla que solo emiten fluorescencia cuando hibridan con la diana, separando un fluoróforo de un quencher.
• Sondas FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): Utilizan dos sondas marcadas con diferentes fluoróforos (donador y aceptor) que hibridan en proximidad sobre el amplicón, permitiendo la transferencia de energía y la emisión de fluorescencia por el aceptor.

PCR in situ

La PCR in situ se realiza directamente sobre un corte de tejido o una preparación celular, permitiendo la amplificación y detección de secuencias de ADN o ARN in situ, es decir, en su localización celular o tisular original, sin necesidad de extracción previa del ácido nucleico. El producto de la PCR se detecta mediante el marcaje directo (por ejemplo, incorporación de nucleótidos marcados durante la PCR) o indirecto (por ejemplo, hibridación con sondas marcadas post-PCR) con moléculas fluorescentes o cromogénicas.

Procedimiento Básico de la PCR in situ:

1. Preparar y cortar el tejido (si es un bloque de tejido).
2. Fijar la muestra (en un portaobjetos, por ejemplo).
3. Permeabilizar las células/tejidos para permitir la entrada de los reactivos de PCR.
4. Añadir la mezcla de PCR (primers, nucleótidos –algunos pueden estar marcados–, polimerasa, tampón).
5. Cubrir la muestra (generalmente con un cubreobjetos sellado) para evitar la evaporación durante los ciclos térmicos.
6. Realizar los ciclos termales en un termociclador adaptado para portaobjetos o sobre la platina de un microscopio con control de temperatura.
7. Lavar para eliminar reactivos no incorporados y cebadores no unidos.
8. Detectar la señal (fluorescencia bajo microscopio de fluorescencia, o desarrollo de color si se usan sustratos cromogénicos).

PCR Asimétrica

Esta variante de PCR está diseñada para amplificar preferentemente una de las dos hebras del ADN diana, resultando en una acumulación de producto monocatenario. La amplificación del producto monocatenario es predominantemente lineal, no exponencial, una vez que el cebador limitante se agota. Esto se logra utilizando concentraciones muy dispares de los dos cebadores (uno en gran exceso y el otro en cantidad muy limitante) o, en algunos casos, un solo oligonucleótido cebador (aunque esto es menos común para la generación de producto específico).

• Aplicación principal: Generación de ADN monocatenario para técnicas como la secuenciación por el método de Sanger o la preparación de sondas de hibridación.

PCR Digital (dPCR)

La dPCR es una técnica de cuantificación absoluta de ácidos nucleicos. Se basa en la partición de la muestra de reacción (que contiene los reactivos de PCR y la muestra de ADN/ADNc) en miles o millones de reacciones individuales de muy pequeño volumen (nanolitros o picolitros). Estas particiones pueden ser gotas en una emulsión agua-aceite (ddPCR o droplet digital PCR) o pocillos en un chip microfluídico. Esto permite una cuantificación directa del número de moléculas diana presentes en la muestra original sin necesidad de curvas de calibración o estándares externos (aunque los controles siguen siendo importantes).

Pasos Fundamentales de la dPCR:

1. Partición de la Muestra: La mezcla de reacción (que puede tener un volumen inicial típico, por ejemplo, 20 µL) se divide en un gran número de particiones discretas. La dilución es tal que algunas particiones contendrán una o más moléculas de la diana, mientras que otras no contendrán ninguna.
2. Reacción de PCR: Se realiza la PCR en un termociclador convencional. En cada partición individual, la reacción de amplificación ocurrirá si al menos una molécula de la secuencia diana estaba presente en esa partición.
3. Detección y Cuantificación de Particiones: Después de la PCR, se determina en cada partición si la amplificación ha ocurrido (partición positiva, generalmente detectada por fluorescencia) o no (partición negativa). Se cuentan el número de particiones positivas y negativas.
4. Análisis Estadístico y Lectura Digital: Aplicando la estadística de Poisson a la fracción de particiones positivas, se calcula la concentración absoluta de la molécula diana en la muestra original, expresada típicamente como copias por unidad de volumen (por ejemplo, copias/µL).