mapas genéticos y físicos
mapas genéticos: mapas de ligameniento
mapas físicos
Se basan en el análisis directo del ADN ubican los genes en relación con distancias medidas en número de pares de bases, kilobases y megabases.
mapeo de restricción
determina sitios restriccio
secuencia basada en mapas
Consiste en ensamblar fragmentos cortos secuenciados en una secuencia del genoma completo. DIgestion parcial: cortes aleatorios y diferentes.
contig
Un conjunto de dos o más fragmentos de DNA solapados que forman un segmento se llama contig.
SHOT GUN
El ADN genómico se corta en numerosos fragmentos pequeños superpuestos que son clonados en bacterias. Se secuencia cada fragmento. Se utiliza el solapamiento de la secuencia para ordenar los clones y se ensambla todo el genoma mediante poderosos programas informáticos.
La normalización sirve para minimizar la variabilidad intra e inter-grupo, preservando la variación biológica. La variabilidad sistemática es aquella que afecta por igual a todas las mediciones del array (condiciones del experimento).
ANÁLISIS EXPRESION DIFERENCIAL
encontrar qué genes están sobreexpresados o inhibidos significativamente en nuestra muestra problema, respecto a un control
el análisis de clusters
sirve para ver qué grupos de genes varían de forma similar.
Enriquecimiento funcional
Herramienta que permite estudiar la sobreexpresión de los genes para determinar posteriormente los procesos biológicos (vías metabólicas) en los que están integrados.
términos GO
es proporcionar vocabularios controlados para describir la función molecular , el proceso biológico y el componente celular de los productos génicos.
Secuenciación por bisulfito
La secuenciación por bisulfito permite realizar un mapeo de metilaciones alelo-específicas en las islas CpG lo que añade la posibilidad de observar las metilaciones además de la secuencia nucleotídica. El bisulfito actúa desaminando las citosinas del ADN convirtiendo estas en uracilo. La base del método es que el bisulfito por sus propiedades fisicoquímicas es incapaz de actuar sobre las citosinas que se encuentren metiladas, que son conocidas como 5‐metilcitosina. OBservacion de metilacion de todo el genoma, busqueda de regiones mediadas diferencialemnte, conversion por bislufito, disgestion y luego pCR.
complejos remodeladores de la cromatina
complejos remodeladores de la cromatina, las características compartidas son que tienen más afinidad por el ADN en nucleosomas que por el ADN desnudo. Presenta un dominio con actividad ATP-asa separado en dos partes (DExx y HELICc). Actúan sobre nucleosomas, tienen un dominio que regula la actividad ATP-asa y forman complejos con otras proteínas que modulan su acción por lo que, da especificidad.
Disbiosis: desequilibrio en la composición bacteriana de un nicho ecológico en comparación con el patrón considerado normal.
Metagenoma: genoma colectivo del conjunto de microorganismos que constituyen una comunidad ecológica.
Metagenómica: estudio del material genético de las muestras recuperadas directamente de un determinado entorno biológico para conocer su composición microbiana, sin aislamiento y cultivo de sus componentes.
Microbioma: genoma colectivo del conjunto de simbiontes que colonizan un nicho ecológico o animal anfitrión.
Microbiota: conjunto de comunidades microbianas que coloniza un determinado nicho ecológico.
Sec ARNr 16S(Bact y archae) o Shotgun (todos los micros)
Metaboloma y metabolómica
El metaboloma es el conjunto completo de metabolitos en un organismo. La metabolómica es la ciencia que estudia el metaboloma.
Hay dos estrategias principales para trabajar en metabolómica:
No dirigido (huella metabólica): estudia las diferencias en la abundancia relativa de metabolitos entre grupos. Es ideal para encontrar nuevos biomarcadores. Comprender los procesos biológicos, no se necesitan conocimientos previos ni hipótesis.
Dirigido: cuantificación precisa de un conjunto limitado de metabolitos. Necesita conocimiento previo.
Tecnicas: LC-MS, GC-MS, CE-MS, RMN
Proteómica
La proteómica plantea objetivos:
Sistemático: estudio global de la expresión proteica, es decir, identificación de todas las proteínas en referencia a un estado fisiológico determinado.
Pragmático: propone comparar la expresión proteica de dos situaciones fisiológicas y establecer mapas bidimensionales.
Los dominios son porciones discretas de las proteínas que se pliegan independientemente del resto de proteínas y tienen su propia función y sirven como uno de los componentes básicos de esas proteínas.
El motivo son dominios que contienen una región conservada de un patrón de aminoácidos o una combinación conservada de los elementos estructurales que se encuentran cerca de las secuencias de aminoácidos.
Tecnologías convencionales: Tecnologías basadas en cromatografía: ELISA Western blotting Tecnologías avanzadas: Microarrays de proteínas:Espectrometría de masas Edman sequencing Tecnologías basadas en gel:
Tecnologías cuantitativas: ICAT SILAC iTRAQ
Tecnologías de alto rendimiento X-RAY crystallography NMR spectroscopy
ELISA y Western blotting
El ELISA es un inmunoensayo altamente sensible y ampliamente utilizado con fines diagnósticos. utiliza el antígeno o anticuerpos en la superficie sólida y la adición de anticuerpos conjugados enzimáticos para medir las fluctuaciones en las actividades enzimáticas que son proporcionales a la concentración de anticuerpos y antígenos en el espécimen biológico determinado.
Western blotting es detección/separación de proteínas de baja abundancia que implican la separación de proteínas mediante electroforesis, la transferencia a la membrana de nitrocelulosa y la detección precisa de una proteína diana por anticuerpos conjugados enzimáticamente.
Inmunoprecipitación de cromatina es un método bioquímico usado para determinar los sitios de unión en el genoma de diversas proteínas in vivo, como histonas modificadas y también se emplea para estudiar la unión de factores de transcripción al ADN.
CROM DE INT IONICO (IEC): purificación de proteínas sobre la base de grupos cargados en su superficie. Las proteínas varían entre sí en su secuencia de aminoácidos; ciertos aminoácidos son aniónicos mientras que otros son catiónicos.
CROM DE EXCLUSION MOL (SEC) separa las proteínas a través de una matriz portadora porosa con un tamaño de poro distinto sobre la base de la permeación; por lo tanto, las proteínas se separan sobre la base del tamaño molecular.
CROM DE AFINIDAD:la interacción reversible entre el ligando de afinidad de la matriz cromatográfica y las proteínas a purificar.
SDS-PAGE es una técnica de alta resolución para la separación de proteínas según su tamaño, facilitando así la aproximación a su peso molecular.
2D-PAGE se separan por carga en la primera dimensión mientras que en segunda dimensión se separan sobre la base de las diferencias entre su masa
Espectrometría de masas
La espectrometría de masas es una técnica analítica en la que los átomos o moléculas de una muestra son ionizados, con mayor frecuencia positivamente, separados por su relación masa/carga (m/z) y posteriormente detectados y registrados Introducción de la muestra.
Ionización de la muestra, en la que se transforman los átomos o moléculas en especies iónicas en fase gaseosa, con la consiguiente pérdida de electrones o protones. Separación y el análisis de los iones moleculares y de los fragmentos cargados producidos según su relación m/z. espectro de masas, en el que se presenta la abundancia relativa de los iones y fragmentos separados respecto a la relación masa/carga.
Triple cuadrúpolo: identificar secuencias aminoácidicas
Cuadrupolo-TOF: identificación de proteínas mediante secuenciación de aminoácidos y caracterización de las modificaciones de las proteínas.
MALDI-TOF: fingerprinting de la masa peptídica.
MALDI-QqTOF: fingerprinting de la masa peptídica y secuenciación aminoacídica.
FT-ICR: se puede usar para el análisis de mezclas complejas. Cuando se junta con ESI, se puede usar para estudiar las interacciones proteicas y sus conformaciones.
CUADRUPOLO:Consiste en 4 varillas paralelas de metal: dos de ellos que presenta un potencial positivo y los otros negativos. Se aplica un voltaje que influencia la trayectoria de los iones que viajan entre dos varillas. Para un cierto voltaje, solo algunos iones con cierta m/z llegarán al detector.
TOF: la relación entre la masa y la velocidad de los iones. Da una medida muy precisa del período de tiempo desde la aceleración de los iones en la fuente (source) hasta que impactan con el detector MIDE tiempo que necesitan los iones acelerados para recorrer una distancia (L), sin que los iones estén sometidos a un campo eléctrico y/o magnético.
ESI: ionización a presión atmosférica que se aplica a un amplio grupo de muestras y especialmente se utiliza para la caracterización de biomoléculas
MALDI:técnica de ionización suave utilizada en la espectrometría de masas para analizar moléculas más grandes que son no volátiles o térmicamente inestables permite la desorción y la ionización de moléculas completas .
SECUENCI DE EDMANN
La secuenciación de Edman péptido que se va a secuenciar se absorbe a una superficie sólida, normalmente una fibra de cristal. El reactivo Edman, se añade al péptido absorbido junto con una solución buffer. Esto reacciona con el grupo N-terminal. Luego se separa el N-terminal mediante la adición de ácido anhídrico. Se lava y se identifica mediante cromatografía, esto se repite tantas veces.
La técnica huella peptídica (PMF) – identificación de proteína donde la masa de una proteína desconocida se puede determinar. Se suele acoplar a un espectrómetro de masas como MALDI-TOF o ESI-TOF.
Separación de proteínas cortar bandas proteicas o manchas de geles 1-D o 2-D PAGE.
Digestión de la proteína en pequeños péptidos mediante tratamiento proteolítico. Normalmente mediante la enzima tripsina.
Espectrometría de masas Análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas. se genera un pico.
Digestión in sillico- proteínas de las bases de datos y la generación de la lista de picos teóricos.
Comparación De la lista de picos y la lista de picos teóricos para lograr la mejor combinación.
REAC secuenciar polipt: FDBN reac con g amino libres
crom liquida técnica instrumental analítica avanzada que combina las capacidades de separación física con las capacidades de análisis de masas de la espectrometría de masas.
La solubilidad se da gracias a los grupos radicales polares, estos se localizan en la superficie externa. Se establecen puentes de hidrógeno con el agua. La solubilidad se basa en la interacción de las cargas positivas y negativas, distribuidas en la superficie de la proteína
biuret: Cu2+–> morado
lowry: 1. biuret 2. folin. color azul
turbidimetria: turbidez
capacidad amortiguadora, destacamos que son anfóteras debido a los grupos radicales, es decir, se pueden comportar como ácidos y como bases
La formación del enlace peptídico entre dos aminoácidos es un ejemplo de una reacción de condensación. Dos moléculas se unen mediante un enlace de tipo covalente CO-NH con la pérdida de una molécula de agua y el producto de esta unión es un dipéptido.
Modelo del rompecabezas (jigsaw puzzle). Diferentes moléculas se pliegan de manera diferente y solo convergen las rutas en el estado nativo.
Modelo del armazón (framework). Se forman los elementos claves de estructura secundaria que difunden hasta dar la forma nativa
Modelo clásico de nucleación. Una serie de residuos próximo nuclea, forma estructura secundaria y alrededor de este núcleo se estructura la proteína.
Modelo de colapso hidrofóbico. La proteína colapsa rápidamente por sus residuos hidrofóbicos dando una estructura compacta que luego se reorganizara para dar la forma nativa.
Modelo de nucleación-condensación. Se forma un núcleo difuso no estable, sin estructura secundaria sobre el que colapsa la proteína formándose la estructura secundaria y terciaria casi simultáneamente.
La cristalografía de rayos X puede considerarse como una microscopía de muy alta resolución, mediante la cual podemos visualizar estructuras a nivel atómico. Con ella se ha podido averiguar la estructura y el mecanismo molecular y de actuación de moléculas biológicas de origen diverso, como proteínas, ácidos nucleicos, etc. También puede utilizarse en el diseño racional de fármacos.
Los rayos X son radiaciones electromagnéticas penetrantes, producidas por el bombardeo de un blanco con electrones de alta velocidad. Son absorbidos diferentemente al atravesar materia de composición, densidad y espesor variable. Son reflectados, difractados, refractados y polarizados. Son capaces de producir reacciones biológicas, como el daño o muerte de células vivientes como así también producir mutaciones genéticas. Su poder de ionización depende de su longitud de onda.
NMR espectroscopia técnica analítica utilizada para caracterizar moléculas orgánicas mediante la identificación de marcos de referencia carbono-hidrógeno en las moléculas. Explota las propiedades magnéticas de los núcleos atómicos. Determina las propiedades fisicoquímicas de los átomos o de las moléculas que lo contiene. Proporciona información detallada sobre la estructura, dinámica y, ambiente químico de las moléculas.
Criomicroscopía electrónica microscopía electrónica en la que la muestra se estudia a temperaturas criogénicas, evitando así la generación de artefactos. Se trata de una técnica muy utilizada en biología estructural, pues permite observar directamente (sin tinciones ni fijaciones) estados conformacionales nativos a resolución atómica.
modelado ab initio tratan de construir modelos proteicos desde cero, basándose, por ejemplo, en principios físicos más que directamente en estructuras resueltas previamente.
modelado comparativo de proteínas utiliza estructuras resueltas previamente como puntos de partida o plantillas.