TEMA 6: MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN: cultivo al crecimiento de una pob microbiana en un medio artificial. Normal/, todo examen bacteriológico necesita del cultivo del germen a examinar: a menudo es necesario para la evidenciación de las bacterias, esto ocurre siempre q su núm sea demasiado peq, para q podamos descubrirlas x un simple examen microscópico. Casi siempre es necesario para la identificación de las bacterias aisladas, pues los caracteres morfológicos observados al microscopio son, casi siempre, insuficientes. Siempre es necesario para el aislamiento de las distintas especies bacterianas presentes en un producto patológico y para estudios complementarios, como las pruebas de sensibilidad de las bacterias a los distintos antibióticos. Los microorg viven y se desarrollan en ambientes muy diversos. Para poder cultivarlos en el laboratorio necesitamos medios adecuados, son los medios de cultivo.
Ya Pasteur y Koch pensaron en la necesidad de emplear alguna sust donde los microorg encontraran unas condiciones de vida lo + parecidas a las de su vida natural. Se podrían definir como: el conjunto de prod nutritivos y de soxte q forman el ambiente sobre el q van a crecer y se van a desarrollar los microorg, para poderlos aislar e identificar. Estos medios son preparados sólidos, líquidos o semisólidos q constituyen ambientes artificiales lo + parecido posible a los naturales donde se desarrollan estos microorg.
CARACT DE MEDIOS DE CULTIVO:
Deben reunir una serie de requisitos:
1. Contener sust quím (nutrientes) necesarias para el crecimiento del microorg
2. Ser estéril en el momento de utilización, ya q la >ría de los estudios se realizan con cultivos puros. De lo contrario, después de incubado tendríamos una mezcla de microorg junto al q qremos estudiar.
3. Encontrarse en recipientes (tubos, placas, etc.
) q permitan mantener su esterilidad y q sean fáciles de manejar.
4. Poseer una serie de caract físicas y quím adecuadas para el desarrollo de microorg: pH, O2, Ta, presión osmótica, humedad, etc.
En principio, un medio de cultivo no debe contener sust q inhiban el crecimiento de los microorg. Algunos son capaces de crecer en un medio simple, es decir, poco rico, pero otros son + exigentes y necesitan para crecer lo q dn factores de crecimiento.
NECESIDADES NUTRITIVAS DE BACTERIAS. COMP + IMXT DE MEDIOS DE CULTIVO:
> parte de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre q el medio les proxcione, en forma asimilable, todos los elementos necesarios para su crecimiento y multiplicación. Las necesidades nutritivas de las bacterias son extremada/ variables, pero como seres vivos q son necesitan obtener del medio, x las reac de su metab, los nutrientes, a los q podemos agrupar en sust energéticas y sust plásticas; en gral, precisan para su desarrollo q en el medio existan: compuestos de C, de N, sales minerales, agua y factores de crecimiento. De estas susts obtendrán la È y los elementos necesarios para la sínt de comp bioq q van a formar parte de sus propias estructuras cel: prot, ác nucleicos, HC y lípidos.
Comp de C:
actúan como sust energét en procesos de oxid, proxcionando È necesaria para sínt de prot, ác nucleicos, etc. Ad actúan como sust plásticas, proxcionando los elementos bioq necesarios para dicha sínt. Algunas bacterias son capaces de utilizar CO2 atm, son microorg autótrofos. S e, la >ría de las bacterias y entre ellas todas las ”médicas”, exigen una fuente de C org, q puede ser muy variable: ác acético, citrato sódico, alcohol, Glu o sust + complejas como polisacáridos, aminoác, AG, etc., son microorg heterótrofos. Algunas bacterias son omnívoras, e d, q pueden utilizar un gran núm de susts dist. Otras tienen necesidades muy específ. X otra parte, algunos HC se añaden a los medios de cultivo, no sólo como nutrientes sino como medio de identificación de microorg, para poder investigar su capacidad fermentativa y realizar las pruebas bioq correspondientes, ej; medio de Kligler con Glu y lactosa q se utiliza para identif de enterobacterias.
Comp de N:
se utilizan tb como sust energ pero, sobre todo, como sust plásticas en sínt de prot, ác nucleicos, etc. Existen bacterias q utilizan el N atm, pero la >ría necesitan un N inorg combinado (NO3-, NO2-, NH3 o sales amónicas), o mejor una fuente de N org como aa, polipéptidos, peptonas, etc.
Iones:
se añaden al medio en forma de sales minerales: su misión es mantener la presión osmótica, el estado coloidal y el equil ác-base. Ad forman parte de enz, coenz o activ enzimáticos. Los + imxtantes son:
Azufre:
necesario para formar aá azufrados. Práctica/ todos los microorg utilizan los sulfatos como fuente de S, no obstante a ciertas bacterias se les debe proxcionar en forma org.
Fósforo:
interviene en los mecanismos de transxte de È y en la comp de fosfolípidos, ác nucleicos y diversos coenz. Todas las bacterias utilizan el P de los fosfatos.
Metales:
se añaden al medio en peq concentraciones (10-4 – 10-5 g/l). Son, x ej:
Fe, q forma parte de catalasa, peroxidasa, citocromos, etc., Mg, K, Ca.
Oligoelementos:
como Mn, Cu, Co, Zn, Mo, etc.
Están gral/ presentes como impurezas en comp del medio, x lo q no es preciso añadirlos. Algunos forman parte de coenz.
Agua:
imprescindible para q los alimentos sólidos, O2 y prod de desecho, entren y salgan en las cél, disueltos. Mantiene el grado de humedad q requieren los microorg para su vida. Se utiliza agua destilada o desionizada para q no contenga sales, pues alteraría la presión osmótica y podría formar complejos insolubles con fosfatos de los medios de cultivo. Ad el agua corriente lleva iones Ca y Mg q pueden reaccionar con otros comp del medio de cultivo, formando comp insolubles q precipitan.
Factores de crecimiento:
comp org esenciales para algunas bacterias (aá, vit, bases nitrog, etc.), q hay q añadir a los medios de cultivo xq, x su complejidad, los microorg son incapaces de sintetizar.
Factores de arranq:
sust necesarias para q el microorg empiece su desarrollo, como Glu para el Neumococo o la sangre para el bacilo de Bordet-Gengou (Bordetella pertussis).
De todos los componentes mencionados, cuantitativa/ se requieren en gran cantidad los compuestos de C, de N y el agua. En < cant =»» s=»» y=»» p,=»» y=»» el=»» resto=»» sólo=»» en=»» cant=»»>
SUSTS Q SE AÑADEN CON FRECUENCIA A MEDIOS DE CULTIVO:
Prot complejas:
como sangre, suero sanguíneo, huevo, etc. Se utilizan para enriqcer el medio.
Peptonas:
cad de aá + cortas q lasprot, yx tanto + fáciles de asimilar q éstas. Están formadas x una mezcla de sust hidrosolubles, prod de la degradación de prot y se obtienen x la actuación de enz proteolíticos, como pancreatina, pepsina, etc, sobre sust proteicas: carne, pescado, huevos, caseína, etc. Son fuentes de C, N, S y È.
Hidrolizados proteicos:
susts q se obtienen x hidrólisis quím de las prot. Como esta hidrólisis es muy fuerte, destruye muchos aá, x lo q se emplea mucho – q la enzimática.
Macerados:
prod obtenidos x extracción acuosa simple. Puede hacerse en frío (maceración) o en caliente (infusión o decocción). A menudo se suelen preparar de forma mixta, e d, unas horas a Ta ambiente y de 15 a 20 m en caliente.
Extractos:
macerados concentrados y preparados industrial/ y q se encuentran como tales en el comercio. Son muy empleados y dan buenos resultados. Los + empleados son: A)
Extractos de carne:
Se preparan cociendo la carne sin grasa en agua y evaxando y concentrando al vacío el extracto. Contienen los comp hidrosolubles de la carne. Son factores estimulantes del crecimiento, ricos en prot, prod nitrogenados como creatina, bases púricas y bases pirimidínicas y prod no nitrogenados como glucógeno y sales minerales. B)
Extractos de levadura
Proxcionan factores de crecimiento, sobre todo comp nitrogenados.
Cloruro sódico:
se añade para evitar la plasmolisis, logrando una presión osmótica adecuada para q la bacteria no se lise.
Ag solidificantes:
se añaden para transformar un medio líq en sól o semilíq. Son sust q permiten solidificar los medios de cultivo para así visualizar mejor el crecimiento y poder aislar colonias. El agente solidificante no debe ser usado como nutriente ni alterado x microorg. Son agentes solidificantes: A)
Silica-gel
Silicato de sodio al 10%. Se usa para el cultivo de microorg autótrofos, cuando es necesaria la ausencia total en el medio de sust org. En clínica no tiene interés. B)
Gelatina
Prot q se obtiene x hidrólisis del colágeno. Es insoluble en agua fría y soluble en agua caliente. Cuando se enfría forma un gel transparente. Actual/ debido a 2 inconvenientes fund, se usa poco; estos inconvenientes son: ser hidrolizado x num bacterias y fundir a 28ºC. C)
Agar-agar
Constituye el soxte ideal para el aislamiento de las colonias. Es una sust mucilaginosa extraída de las algas rojas. Se disuelve en agua caliente (80ºC), y al enfriarse permanece en estado líquido hasta 45ºC-50ºC. X debajo de 42ºC solidifica formando un gel consistente de color amarillo claro. En medio ác no solidifica. Para preparar un medio sól se requieren de 10 a 15 g/l, y para preparar uno semisól de 1 a 7g/l.
Indicadores ác-base:
sust q cambian de color con la variación del pH. Se adicionan a los medios de cultivo para q nos orienten sobre el tipo de metab q tiene la bacteria q ha crecido. El pH del medio varía x el metab bacteriano, sobre todo x la fermentación de HC y de prot presentes en el medio, esta fermentación produce ác en el caso de los HC y bases en el de las prot, lo q hace q ! O ¡ pH del medio, haciendo virar el color del indicador. Así sabremos si la bacteria ha utilizado unos u otras. Puede haber bacterias q utilicen los HC y después las prot.
NECESIDADES É DE MICROORG:
1 Sg la fuente de È q utilicen:
A
Fotótrofas o fotosintéticas: obtienen È de la luz solar x reac fotoquím.
B
Quimiótrofas o quimiosintéticas: obtienen la È de oxid de comp quím.
C
Parátrofas: aprovechan la È de célula q parasitan.
2
Sg su capacidad de sínt, es decir, sg la naturaleza del sustrato oxidable, se clasifican en:
A Autótrofas o litótrofa: son bacterias con gran capacidad de sínt, q obtienen C y N de comp inorg (CO2, NH3, NO2 –, etc.) e incluso de elementos quím (H2, S, Fe, N2 at, etc.). No necesitan añadir al cultivo factores de crecimiento.
B
Heterótrofas u organótrofa: necesitan comp org como sustrato.
C
Hipótrofas: q son parásitos intracel pues carecen de sist enzimát desarrollados.
3
Sg tipo de È q utilizan y naturaleza del sustrato oxidable, se pueden dividir en:
A
Bactfotoautótrofas o fotolitótrofas o autótrofas fotosintéticas: utilizan È luminosa y un comp inorg como sustrato oxidable.
B Bact fotoheterótrofas o fotoorganótrofas o heterótrofas fotosintéticas: utilizan È solar y un comp org como sustrato.
C
Bact quimioautótrofas o quimiolitótrofas o autótrofas quimiosintéticas: utilizan È quím liberada de la oxidación de comp inorg.
D
Bact quimioheterótrofas o quimioorganótrofas o heterótrofas quimiosintéticas: utilizan È liberada x la oxidación de comp org. La >ría de bacterias son quimioheterótrofas.
COND FÍS-QUÍM Q DEBEN TENERSE EN CUENTA PARA OBTENER UN BUEN CULTIVO MICROBIANO:
Concentración H+:
el pH mide la concentración de iones H+. En nuestro caso, nos va a indicar las condiciones de acidez o basicidad de un medio de cultivo. Es un factor muy imxtante para el desarrollo de los microorg, ya q la mayor parte de estos sólo puede vivir entre estrechos márgenes de pH. En gral, el crecimiento ópt de la >ría de las bact patógenas tiene lugar a pH neutro o ligera/ alcalino (6,5 a 7,5) Hay microorg q se salen de estos valores, como el Lactobacillus, q necesita, para q su crecimiento sea óptimo, un pH de 4, y el Vibrium comma o V. Cholerae, q necesita un pH entre 8 y 9. Muchas bact son sensibles a las variaciones de pH q se producen en el curso del cultivo: acidificación x el catabolismo glucídico o alcalinización x el catabolismo proteico. Es necesario pues tamponar el medio para mantener, durante el cultivo, el pH dentro de los límites fisiológicos. Otras veces sin embargo, lo q nos interesa es ver precisa/ ese cambio de pH.
Concentración O2:
no todos los microorg necesitan = cant de O2 molecular para vivir, incluso muchos no soxtan la presencia de éste. La presencia o ausencia de O2 en el lugar donde se van a desarrollar microorg es fund para q crezcan o no. Las bacterias, según sus necesidades de O2, se clasifican:
1 Aerobias obligadas o estrictas:
necesitan la presencia de O2 libre para su desarrollo, siendo incapaces de vivir en ausencia de éste. Esto está relacionado con la existencia de sist enzimáticos necesarios para la respiración aerobia. Su È la obtienen de la degradación oxidativa de HC, produciendo CO2 y HO2. Como en el transcurso del metab aerobio pueden formar H2O2, q es tóxico para ellas, deben producir una enz, la catalasa, q lo descompone en H2O + O2. Un ej: de bacteria patógena q es aerobia obligada, es Corynebacterium difteriae.
2 Anaerobias obligadas o anaerobias estrictas:
son incapaces de vivir en presencia de O2, pues es tóxico para ellas. La toxicidad del O2 puede deberse, a q los anaerobios en presencia de O2 formen H2O2 y no tengan la catalasa necesaria para destruirlo, x lo q morirían, o bien a q algunas enz necesarias para el metab anaerobio sean O2 lábiles, e d, activas en su forma reducida, pero inactivas en su forma oxidada. Obtienen la È de reac de oxidación-reducción q no precisan O2, como la ferment y la respir anaerobia. X ej: gén Clostridium. Dentro de los microorg anaerobios, se pueden considerar dos grupos: aerotolerantes, q no requieren O2 para vivir y crecen peor en presencia de éste, y obligados propia/ dicho, para los cuales la presencia de O2 es letal. Cultivos en sándwich. Cultivos en tubo con tapón de vaselina
3 Aerobias facultativas o anaerobias facultativas:
pueden vivir tanto en presencia como en ausencia de O2 libre, ya q poseen las enz necesarias para los 2 tipos de metab, utilizando unas u otras sg la cant de O2 presente. Su crecimiento suele ser óptimo en atmósferas pobres en O2. Éste es el grupo + num de bacterias, y se incluyen la >ría de las patógenas.
4 Microaerófilas:
aq precisan O2 libre para crecer, crecen mejor con cant de O2 < a=»» las=»» q=»» existen=»» en=»» la=»» atmósfera,=»» pues=»» sus=»» sist=»» enzimáticos=»» son=»» sensibles=»» a=»» oxidaciones=»» intensas,=»» inhibíéndose=»» su=»» crecimiento=»» a=»» concentraciones=»» de=»»>2 > q la atmosférica.
5 Carboxífilas o capnófilas:
crecen mejor cuando están en una atmósfera con un 5 – 10% de CO2.
Temperatura:
es otro factor decisivo para el desarrollo de las bacterias. Existe una Ta ópt de crecimiento para cada microorg. X debajo del mín de Ta ópt cesa el crecimiento, pero el microorg qda en estado de vida latente, sin q se produzca la muerte bacteriana hasta Ta muy extremas. S e, a Ta > q la máx, enseguida ocurre la muerte bacteriana. La Ta ópt para la >ría de las bact patógenas oscila 30º-43ºC, siendo la ideal próx 37ºC. Existen excepciones, como los microorg termófilos q tienen Ta ópt de crecimiento de alrededor de 55ºC, y los psicrófilos q crecen mejor x debajo de los 20ºC. La >ría de los hongos y levaduras crecen mejor a Ta ambiente, próx a 30ºC.
Presión osmótica:
la >ría de las bacterias toleran bien la hipotonía, pudiéndose hacer perfecta/ una suspensión de microorg en agua destilada. Esta resistencia se debe a la rigidez de la pared celular. No obstante se suele trabajar en medios isotónicos. Salvo ciertas bact, q necesitan para vivir una concentración salina muy fuerte, como bact marinas, la >ría de los microorg son + sensibles a la hipertonía, no tolerando concentraciones extremada/ elevadas de iones (salazón).
CLASIFICACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO: X sus funciones o utilización:
Medios de conservación o mantenimiento de cepas:
son en gral medios pobres q mantienen las bact en un estado de vida latente. Se utilizan los mismos medios q para transxtar las bact.
Medios de transxte:
son los utilizados para asegurar la viabilidad de las bact desde el momento de la toma de la muestra hasta su posterior siembra en el laboratorio, o para su envío de unos laboratorios a otros. X ej:Stuart, Amies, etc.
Medios comunes o grales:
son los q sirven para una amplia variedad de microorg sin exigencias nutritivas especiales. X ej: caldo nutritivo, agua peptonada, agar común, Mueller-Hinton, TDA,etc.
Medios enriqcidos:
son los q junto con las sust nutritivas incorxamos prod q estimulan el crecimiento de unos det microorg + exigentes. X ej: agar-sangre, agar-chocolate, etc.
Medios de enriqcimiento o especiales:
son los q favorecen + el crecimiento de un germen q el de otro, presentes ambos en el inóculo, ya q tienen en su composición, una serie de sust q retrasan el crecimiento de un gr de bact y otras q estimulan el crecimiento de las q qremos estudiar, o bien, contienen sust q retrasan el crecimiento de un gr de bact y no de otras. X ej:caldo selenito, q es un medio de enriqcimiento para Salmonella: tiene selenito sódico q retrasa el crecimiento de bacilos coliformes y de cocos Gram+ impidiendo su multiplicación en las primeras 4-6 horas, pero no el de la Salmonella, q crece desde el principio, favoreciendo así su incremento en núm respecto al resto de la flora acompañante. X ello la resiembra a partir del selenito debe hacerse a las 4-6 horas de haberse sembrado, q es cuando el medio es + rico en Salmonella.
Medios selectivos o de aislamiento:
son los medios a los q hemos añadido inhibidores específicos de ciertas bact con el fin de q sólo crezcan en el cultivo las bact q qremos estudiar. X ej: Lowenstein-Jensen q contiene verde de malaquita lo q le hace selectivo para micobacterias, ad está enriqcido con huevo para favorecer su desarrollo. El medio de Thayer-Martín es un agar chocolate, fabricado con agar Mueller-Hinton como agar base, q lleva en su comp una serie de antibióticos: Vancomicina (inhibe Gram+), Polimixina o Colistina (inhibe Gram-), y Nistatina (inhibe levaduras). Sobre este medio se han introducido modif, como la inclusión del antibiótico Trimetroprim, inhibidor de las sp del gén Proteus q crecen invadiendo la placa.
Tb hay medios selectivos en los q para favorecer el crecimiento de un det microorg, se manipulan factores ambientales como la Ta: 60ºC para Streptococcus faecalis, 44ºC para E.Coli, etc., el pH: agua de peptona alcalina para Vibrium cholerae. Para favorecer el crecimiento de Lactobacillus, se puede añadir ác acético a un medio común para bajar el pH hasta 5.4. Presión osmótica: el medio Chapman lleva un 7.5% de ClNa, lo q le proxciona una alta presión osmótica q le hace muy selectivo para el estafilococo. Concentración de O2: el mismo Thayer-Martín, q hemos nombrado antes, se hace aún + selectivo para Neisseria meningitidis y Neisseria gonorreae, si se incuba en atmósfera de CO2. Otros, como el Sabouraud, combinan las susts inhibidoras, en este caso una alta concentración de azúcar, con los factores ambientales: bajo pH (5.6), e incubación a Ta relativa/ bajas (25-30ºC) lo q favorece el crecimiento de los hongos y dificulta el de bacterias. A veces, para hacerlo + selectivo se le puede añadir Cloramfenicol y Cicloheximida
Medios de identificación:
son los q nos ponen de manifiesto carácter bioq de un det germen y nos sirven para identificar y separar familias, gén e incluso sp de bact. X ej: caldo de Clark y Lubs, medio de Hugh-Leifson, C.L.E.D., agar Kligler, agar citrato de Simmons,etc.
Medios diferenciales o de diferenciación:
son medios de aislamiento, y al mismo tiempo son medios de identificación, pues les hemos añadido indicadores de activ bioq e inhibidores. X ej:Mc Conkey, Levine, agar SS, Chapman-manitol, etc.