Introducción a la Ingeniería Genética

«La ingeniería genética consiste en la alteración artificial y deliberada del genoma de un ser vivo, modificando su ADN». Al conjunto de métodos y técnicas utilizados para este fin se le denomina tecnología del ADN recombinante.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

Para obtener copias de un gen, es necesario saber dónde se encuentra y en qué células se expresa. Para ello, utilizamos sondas, que son moléculas de ácido nucleico monocatenario.

Tipos de hibridación:

1. Hibridación ADN-ADN: Transferencia tipo Southern.
2. Hibridación ADN-ARN: Transferencia tipo Northern.

Si la hibridación se realiza en la propia célula, se denomina hibridación in situ.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Kary Mullis (1985) desarrolló la técnica conocida como PCR, que permite obtener en el laboratorio múltiples copias de un fragmento de ADN específico (amplificación).

Componentes necesarios para la PCR:

• Una cadena molde de ADN monocatenario, es decir, cada una de las dos hebras de la doble hélice.
• Una mezcla de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP).
• Un cebador: Fragmento pequeño de ADN monocatenario, complementario a uno de los extremos de la cadena molde.

Secuencia de la reacción:

1. Calentamiento y desnaturalización.
2. Enfriamiento y adición de cebadores.
3. Primer ciclo de síntesis.
4. Ciclos sucesivos de amplificación.

Métodos de Secuenciación de ADN

Conocer la secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de ADN permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen. Sus aplicaciones incluyen:

• Investigación de la base molecular de mutaciones específicas en un gen.
• Revelación de regiones reguladoras comunes a todos los genes.
• Provisión de estimaciones de las tasas de evolución molecular mediante la comparación de secuencias de diferentes especies.
• Determinación de la estructura del genoma (Secuenciación de genomas).

Proyecto Genoma Humano (PGH)

El Proyecto Genoma Humano (PGH) fue un proyecto de investigación científica iniciado en 1990 con el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases químicas que componen el ADN, e identificar y cartografiar los aproximadamente 20.000-25.000 genes del genoma humano desde un punto de vista físico y funcional.

Objetivos principales del PGH:

• Conocer la secuencia de bases de todo el ADN.
• Localizar todos los genes en posiciones exactas.
• Establecer relaciones entre grupos de genes.
• Identificar nuevos genes.

En el año 2000 se obtuvo el primer «borrador», y en 2004 se completó toda la secuencia de nucleótidos del ser humano. Estos trabajos fueron realizados, entre otros, por Craig Venter y la empresa Celera Genomics.

Dato clave: Una pequeña fracción del genoma humano es codificante; más del 90% no es codificante, teniendo función reguladora o siendo de función desconocida.

Mutagénesis Dirigida

La mutagénesis dirigida permite provocar cambios específicos en la secuencia de nucleótidos de un gen. De este modo, es posible obtener proteínas modificadas en aminoácidos concretos de su secuencia.

Para esta técnica se utiliza un oligonucleótido sintético que contiene la secuencia mutada de interés. Su utilidad radica en determinar las regiones de una proteína implicadas en funciones específicas, como el plegamiento, la interacción con ligandos o la acción enzimática.

Tecnología del ADN Recombinante

El ADN recombinante es aquel en el que se han introducido genes exógenos (de otro organismo).

Esta tecnología consiste básicamente en la transferencia de genes desde una célula donante a una célula receptora (ejemplo: una bacteria), en la cual se produce la expresión, es decir, la síntesis de la proteína correspondiente.

Etapas de producción del ADN recombinante:

1. Aislamiento y obtención del gen de interés.
2. Selección del vector de clonación.
3. Inclusión del ADN recombinante en la célula hospedadora.
4. Selección de las células clonadas y expresión de los genes exógenos en el hospedador.

Pasos detallados del proceso:

1. Obtención del ADN donante: Mediante las enzimas de restricción, el ADN donante se corta en pequeños fragmentos. Estas enzimas también cortan los plásmidos de la célula receptora, produciendo roturas similares en ambas moléculas de ADN.
2. Tratamiento con ADN ligasas: Los fragmentos del ADN donante que contienen el gen se unen a los plásmidos, transformándolos en plásmidos recombinantes.
3. Transformación: Los plásmidos recombinantes se incorporan a las bacterias, obteniéndose bacterias modificadas.
4. Clonación de genes: Estas bacterias modificadas se aíslan y se cultivan por separado para obtener clones, los cuales producirán la proteína codificada por el gen donante.

Generación de Fragmentos de ADN: Endonucleasas de Restricción

Las endonucleasas de restricción son enzimas de bacterias que reconocen secuencias específicas del ADN y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato.

Tipos de Endonucleasas de Restricción:

• Tipo I y III: Cortan el ADN en puntos distintos al de reconocimiento (al azar).
• Tipo II: Cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromos. Son las más utilizadas en ingeniería genética.

Tipos de cortes producidos por Endonucleasas Tipo II:

• Corte plano: Produce extremos romos.
• Corte escalonado: Produce extremos pegajosos o cohesivos.

Síntesis de ADN complementario (ADNc): Otra posibilidad para generar fragmentos es utilizar la transcriptasa inversa. Esta técnica se emplea cuando se parte de un molde de ARNm. La ventaja es que se obtiene ADNc sin intrones.

Separación de los Fragmentos de ADN

Una vez que el ADN ha sido cortado con las enzimas de restricción, se obtienen fragmentos de diferente tamaño. Para separarlos y seleccionar el fragmento deseado, se utiliza la electroforesis, normalmente en gel de agarosa o poliacrilamida.

Unión del ADN Recombinante a Vectores de Clonación

Un vector es una molécula de ADN transportadora. Generalmente son plásmidos bacterianos o genomas de virus.

La unión del gen de interés al vector se realiza mediante una ligasa. Al conjunto resultante se le denomina ADN Recombinante.

Introducción en un Organismo Hospedador

El ADN recombinante se introduce en una célula hospedadora, la cual proporciona la maquinaria necesaria para la replicación de las moléculas recombinantes.

Características de la célula hospedadora ideal:

• Crecimiento rápido.
• No patógena ni peligrosa.
• Capaz de captar moléculas de ADN del medio externo e incorporarlas a la célula.

Sistemas de introducción (Transfección):

• Microinyección: Utilizada en animales. Se inyecta el ADN con una aguja muy fina (1,5 micrómetros). Ejemplo: Fecundación de óvulos.
• Electroporación: Mediante impulsos eléctricos, la membrana se hace permeable y el ADN en disolución entra.
• Plásmido Ti: Utilizado en vegetales.

Plásmidos Ti para Células Vegetales

El plásmido Ti, proveniente de Agrobacterium tumefaciens, es el único sistema conocido de transferencia de genes de bacteria a vegetal. El ADN-T se introduce en la célula vegetal y se expresa. Modificando el T-DNA se pueden introducir las secuencias apropiadas.

Selección y Expresión de Genes Exógenos (Clonación en Células Procariotas)

Dado que no todas las bacterias incorporan el ADN recombinante, es crucial seleccionar aquellas que lo portan y, además, lo expresan (utilizando vectores de expresión).

Resumen de pasos de clonación:

• Obtención del gen.
• Selección del vector de clonación.
• Formación del ADN recombinante.
• Introducción en célula hospedadora mediante:
  • Transformación: Captación de moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo (proceso natural). El ADN se inserta en el genoma.
  • Transducción: Introducción a través de un virus bacteriófago.

Comprobación de la expresión del gen clonado:

• Resistencia a antibióticos: Se utiliza para seleccionar las células que han incorporado el gen (si el vector lleva un gen de resistencia).
• Uso de sonda radiactiva o elemento radiactivo.

Aplicaciones de la Ingeniería Genética y la Biotecnología

1. Estudios Evolutivos, Históricos y Arqueológicos

La ingeniería genética permite:

• Amplificar ADN mediante PCR (útil para muestras antiguas o escasas).
• Conservación de genes.
• Establecimiento de relaciones evolutivas.

2. Obtención de Productos de Interés Sanitario

Mediante la clonación de genes y su inserción en organismos (como bacterias o levaduras), se producen proteínas terapéuticas a gran escala. Ejemplos:

• Insulina (producida en Saccharomyces cerevisiae o E. coli).
• Somatotropina (hormona del crecimiento).
• Obtención de vacunas (ejemplo: Hepatitis B).

3. Desarrollo de Vacunas

En la actualidad, las vacunas son sustancias que estimulan la inmunidad.

• Vacunas recombinantes: Son virus a los que se les eliminan los genes que codifican la virulencia, pero se mantienen aquellos que estimulan la producción de anticuerpos.
• Vacunas polivalentes: El genoma vírico modificado contiene genes que codifican factores antigénicos de varias enfermedades, permitiendo la inmunización múltiple.

4. Diagnóstico de Enfermedades Genéticas

La ingeniería genética permite el diagnóstico de enfermedades como la Distrofia muscular de Duchenne y la Fibrosis quística, además de estudios de predisposición a patologías complejas como el Alzheimer o tumores cancerígenos.

5. Organismos Transgénicos

Los organismos transgénicos son aquellos producidos a partir de un organismo modificado mediante ingeniería genética, al que se le han incorporado genes de otro organismo para conferirle características deseadas.

Actualmente, existe una gran presencia de alimentos procedentes de plantas transgénicas, como el maíz o la soja.

Biotecnología Tradicional vs. Ingeniería Genética

Las diferencias entre los productos obtenidos por biotecnología tradicional y los transgénicos radican principalmente en las técnicas utilizadas.

• Biotecnología tradicional: Combina de forma aleatoria los miles de genes de los genomas de dos cepas precursoras, buscando un genoma que reúna los genes beneficiosos de ambos progenitores.
• Ingeniería genética:
  • Es mucho más precisa.
  • Implica direccionalidad (se selecciona el gen específico).
  • Permite transferir genes de unas especies a otras (transgénesis).

Clonación y Células Madre

Clonación Reproductiva

La clonación reproductiva puede definirse como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual, copias idénticas de un organismo, célula o molécula ya desarrollado.

Clonación Terapéutica y Células Madre

Las células madre son células que se encuentran en todos los organismos multicelulares y que tienen la capacidad de dividirse y diferenciarse en diversos tipos de células especializadas.

Tipos de células madre:

• Embrionarias
• Adultas

Terapia Génica: Mecanismos y Aplicaciones

La terapia génica es un tratamiento médico que consiste en la inserción de material genético funcional en las células y tejidos de un paciente para corregir un defecto genético específico o dotar a las células de una nueva función que les permita superar una alteración.

Generalmente, se utilizan vectores adecuados (que suelen ser virus) para introducir el gen correcto, el cual se integra en el ADN de la célula enferma mediante técnicas de recombinación genética.

Criterios para la aplicación de la Terapia Génica:

• La enfermedad debe ser letal y carecer de tratamiento efectivo.
• La causa debe ser un único gen que ya esté clonado.
• La regulación del gen debe ser precisa y conocida.

Formas de tratamiento en Terapia Génica:

1. Sustituir genes alterados: Corrección de mutaciones mediante cirugía génica, sustituyendo el gen defectuoso o reparando la secuencia mutada.
2. Inhibir o contrarrestar efectos dañinos: Se logra mediante la inhibición dirigida de la expresión génica.
3. Insertar genes nuevos: Se introduce una copia de un gen normal para sustituir la función de un gen mutante que no fabrica una proteína correcta.

Nota: La técnica aún está en desarrollo, por lo que su aplicación se lleva a cabo principalmente dentro de ensayos clínicos controlados.