Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos (AN)
Pretratamiento de Muestras
El pretratamiento es crucial para obtener AN de alta calidad. Los métodos varían según el tipo de muestra:
Cultivos Celulares
- Monocapa: Se despegan las células con un raspador o tripsina.
- Suspensión: Se recolectan las células por centrifugación.
Tejidos
- Frescos: Se homogenizan mecánica o químicamente (con proteasas y detergentes).
- Fijados en Formol e Incluidos en Parafina (FFPE): Se desparafinan y rehidratan antes de la homogenización.
Otras Muestras
- Sangre: Se lisan los hematíes y se conserva el sedimento leucocitario.
- Esputo: Se fluidifica con un agente mucolítico.
- Bacterias y Levaduras: Se suspenden en un tampón adecuado.
Extracción de AN
La extracción implica dos procesos principales:
Lisis Celular
Se utilizan detergentes (como SDS y CTAB), EDTA (quelante de cationes divalentes), proteasas (para degradar proteínas) y agentes caotrópicos (como isotiocianato de guanidino) para romper las membranas celulares, liberar los AN e inactivar las nucleasas.
Métodos de Lisis
- Enzimática: Se utilizan enzimas como la lisozima para digerir la pared celular.
- Mecánica: Se emplean métodos como la sonicación o la congelación-descongelación.
Purificación de AN
Se eliminan contaminantes para obtener AN puros. Los métodos comunes incluyen:
Purificación con Solventes Orgánicos
- Eliminación de compuestos solubles en solventes orgánicos.
- Precipitación del ADN con etanol.
- Lavado del ADN.
- Resuspensión del ADN.
Purificación con Sales
- Precipitación de proteínas con altas concentraciones salinas (salting out).
- Precipitación del ADN.
- Lavado y resuspensión del ADN.
Cromatografía
- Intercambio Iónico: Se basa en la unión reversible de iones a grupos funcionales.
- Adsorción: Se utiliza sílice para adsorber los AN en presencia de sales caotrópicas.
Esferas Magnéticas
Se utilizan esferas magnéticas recubiertas con moléculas que se unen a los AN.
Ultrafiltración
Se basa en la retención de moléculas de AN por tamaño mediante un filtro.
Calidad de los AN Purificados
Se evalúa la integridad (tamaño y ausencia de degradación), pureza (ausencia de contaminantes) y concentración de los AN.
Condiciones de Almacenamiento
- ADN: 4°C (corto plazo), -20°C (mediano plazo), -80°C (largo plazo).
- ARN: -20°C (corto plazo), -80°C (largo plazo).
Trazabilidad de Muestras
Es esencial mantener un sistema de trazabilidad para identificar y rastrear las muestras.