Técnicas y Métodos Empleados en Biología Molecular

Historia de la Biología Molecular (Hitos Clave)

La Biología Molecular ha experimentado un rápido desarrollo, marcado por hitos tecnológicos fundamentales:

• 1980: Nace la tecnología del ADN recombinante y la secuenciación de Sanger. También se fabrica la Eritropoyetina (Erythropoietin).
• 1984: Desarrollo de la técnica de huella genética (DNA fingerprint).
• 1990: Nace la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para diagnosticar desórdenes genéticos.
• 2000: Introducción de la secuenciación capilar y los microarrays.
• 2003: Finalización de la secuencia del Genoma Humano.

Aplicaciones de la Biología Molecular

Las técnicas moleculares tienen un amplio rango de aplicaciones, incluyendo:

• Producción de proteínas recombinantes (ej. insulina, interferón (IFN), hormona del crecimiento (GH)).
• Estudio de la patogénesis de enfermedades humanas.
• Identificación de individuos (medicina forense y pruebas de paternidad).

Extracción de Ácidos Nucleicos

La extracción de ácidos nucleicos (ADN o ARN) se puede realizar en cualquier tejido, siempre y cuando las células posean núcleo (ej. glóbulos blancos). El material extraído debe ser de alta calidad; se considera de mala calidad cuando está contaminado. Los ácidos nucleicos extraídos se deben guardar a bajas temperaturas para su conservación.

ADN Recombinante

El ADN recombinante es una molécula de ADN que contiene secuencias provenientes de dos fuentes distintas.

Proceso de Creación del ADN Recombinante

1. Se extrae el plásmido bacteriano (vector).
2. El plásmido es cortado por una enzima de restricción.
3. Se agrega el ADN de origen humano (o de interés).
4. El fragmento de ADN de interés se adhiere al plásmido por medio de la enzima ADN Ligasa.
5. Se obtiene una molécula de ADN recombinante lista para ser clonada y así adquirir productos de interés.

Componentes de una Molécula de ADN Recombinante

• Vector: Plásmido o fago.
• ADN de origen: ADN bacteriano y ADN de origen animal (o de interés).
• Enzimas: Enzimas de restricción y ADN ligasas.

Enzimas Utilizadas en Biología Molecular

Enzimas de Restricción

La enzima de restricción, como la EcoRI (proveniente de Escherichia coli R1), es una enzima que corta el ADN en sitios exactos y específicos, dejando extremos cohesivos (o “pegajosos”). Estas enzimas son utilizadas por las bacterias como un mecanismo de defensa primitivo contra los virus (bacteriófagos).

Existen varios tipos de enzimas de restricción, clasificadas según el sitio de corte y el número de sitios que reconocen:

• EcoRII (35 sitios)
• HindIII (6 sitios)
• HaeIII (>50 sitios)
• BamHI (5 sitios)

Vectores de Clonación

¿Qué es un Vector?

Los vectores son secuencias de ADN que sirven como vehículos de transporte para transferir nuevas secuencias de ADN a células huésped.

Propiedades Esenciales de los Vectores

Origen de Replicación (Ori)

Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de ADN, lo cual le confiere al vector la cualidad de poder replicarse de manera independiente al ADN cromosómico de la célula huésped.

Agente de Selección (Marcador de Selección)

Son genes contenidos en la secuencia del vector que confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.). Estos genes permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, aquellas que contienen el fragmento de ADN de interés.

Sitio de Multiclonación (MCS)

Es una región contenida dentro de las secuencias de los genes marcadores que contiene múltiples sitios de restricción, facilitando la inserción del ADN foráneo.

Clases de Vectores

Los vectores se clasifican según su estructura y capacidad de carga:

• Plásmido: Molécula de ADN circular que se replica de manera autónoma dentro de una bacteria. No está presente en el cromosoma bacteriano y contiene genes de resistencia a antibióticos (ej. AmpR, TetR), el sitio de duplicación (Ori) y sitios de corte.
• Fago: Son virus que infectan bacterias. Molécula de ADN lineal cuyas secciones pueden reemplazarse con ADN extraño sin interrumpir su ciclo de vida.
• Cósmido: Molécula de ADN circular extracromosómico que combina características de plásmidos y fagos.
• BACs (Cromosomas Artificiales Bacterianos): Vectores de alta capacidad.
• YACs (Cromosomas Artificiales de Levadura): Vectores utilizados en eucariotas.
• PACs (Cromosomas Artificiales Derivados de P1).
• MACs (Cromosomas Artificiales de Mamíferos).
• HACs (Cromosomas Artificiales de Humanos).

Librerías Genómicas y de cDNA

¿Qué es una Librería?

Una librería (o genoteca) es una colección de fragmentos de ADN clonados.

• Librería de cDNA: Colección de fragmentos que representan solo los genes que se están expresando en un tejido específico (genes activos).
• Librería Genómica: Colección que representa la totalidad del genoma de un organismo.

Técnicas para el Análisis del Genoma

El proceso general para el análisis genómico incluye los siguientes pasos:

1. Toma de la Muestra: Se toman células nucleadas (sangre, médula ósea o tumor).
2. Extracción del ADN: Se utilizan métodos como Salting out, Chelex o Fenol-Cloroformo.
3. Amplificación y Detección: El ADN se amplifica en un termociclador (PCR) para luego realizar electroforesis o secuenciación.

Pasos de la Extracción por Fenol-Cloroformo

El método de extracción por Fenol-Cloroformo sigue una serie de pasos rigurosos:

1. Toma de la muestra.
2. Agregar Fenol-Cloroformo.
3. Vortex (10 segundos).
4. Centrifugar.
5. Retirar la fase acuosa y agregar acetato sódico.
6. Agregar etanol frío.
7. Centrifugado.
8. Obtención del precipitado de ADN.
9. Vortex y centrifugado final para la precipitación del ADN.

Equipos Utilizados

• Extracción de ADN: Termocicladores (para PCR).
• Secuenciación de ADN: ABI3500 (Secuenciación Sanger), NGS ILLUMINA (Secuenciación Masiva de Alto Rendimiento).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Definición y Fundamento

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), desarrollada por Kary Mullis, es una técnica de biología molecular utilizada para amplificar el ADN in vitro. Permite identificar cualquier clase de organismo o cuantificar material genético, como una carga viral, utilizando cebadores (primers) específicos para amplificar un gen de interés. La amplificación se confirma generalmente mediante una electroforesis.

Ciclos de la PCR

La PCR se lleva a cabo en una máquina termocicladora y consta de tres etapas repetitivas:

1. Desnaturalización: Las dos cadenas de la molécula de ADN bicatenario se separan a una temperatura alta (aproximadamente 95°C).
2. Alineamiento (Hibridación): Los cebadores (primers) se unen a las cadenas molde de ADN.
3. Extensión (Polimerización): La enzima Taq ADN Polimerasa, utilizando el molde y los cebadores, sintetiza nuevas cadenas. Para ello, requiere la presencia de desoxirribonucleótidos (dNTPs). Este proceso aumenta exponencialmente el número de cadenas de ADN.

Clases de PCR

PCR Convencional

Solo busca amplificar el ADN. Se realiza en un tubo que contiene el ADN molde, los cebadores y la Taq polimerasa. La detección se realiza posteriormente mediante electroforesis.

PCR en Tiempo Real (qPCR)

Permite la amplificación y la detección simultánea del producto. La máquina proporciona resultados en tiempo real sobre la cantidad de genoma amplificado o la presencia de mutaciones.

Aplicaciones de la PCR

• Identificación de individuos.
• Estudio de genes y genotipos.
• Diagnóstico de enfermedades.
• Pruebas de paternidad.
• Estudio genómico de tumores.

Secuenciación de ADN

Definición y Objetivo

La secuenciación (originalmente desarrollada por Sanger) es una técnica poderosa que determina la estructura primaria de una molécula de ADN, es decir, el orden y el número de nucleótidos. Utilizando un secuenciador, es posible determinar la secuencia de cualquier genoma o proteína.

Materiales Necesarios para la Secuenciación

Dentro de un tubo de reacción se agregan los siguientes componentes:

1. Muestra de ADN (previamente extraída).
2. Exceso de cebadores (primers).
3. dNTPs (desoxirribonucleótidos).
4. ADN Polimerasa.
5. Dideoxinucleótidos (ddNTPs), marcados con colores fluorescentes.

Mecanismo de los Dideoxinucleótidos (ddNTPs)

Un ddATP (dideoxiadenosina trifosfato), por ejemplo, es un nucleótido que carece del grupo hidroxilo (OH) en el carbono 3′ de la desoxirribosa. Cuando la ADN polimerasa incorpora un dideoxinucleótido, la polimerización se detiene, ya que no se puede formar el siguiente enlace fosfodiéster. Estos nucleótidos de terminación de cadena están marcados con colores específicos para su detección.

Clases de Secuenciación

Primera Generación (Sanger)

Métodos manuales (químicos, sin dideoxi) y automáticos (enzimáticos, con dideoxi). La secuenciación por lectura es de aproximadamente 1 billón de bases por día.

Última Generación (NGS – Secuenciación Masiva)

También conocida como Secuenciación de Alto Rendimiento. Se diferencia de Sanger por su rapidez y capacidad de lectura, alcanzando hasta 2 billones de bases por día.

Aplicaciones de la Secuenciación

Mediante el análisis del electroferograma resultante, se puede observar el perfil genético, por lo cual esta técnica es muy utilizada en la medicina legal y el diagnóstico genético.