Metodología del ADN Recombinante

Introducción a la Recombinación Genética

La recombinación genética es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de ADN de dos orígenes diferentes. La información genética de dos genotipos puede ser agrupada en un nuevo genotipo mediante recombinación genética. Por lo tanto, la recombinación genética es otra forma efectiva de aumentar la variabilidad genética de una población.

Ventajas de la Recombinación Genética

Las ventajas de la recombinación genética son:

• Combinación de cepas superproductoras: Diferentes cepas superproductoras pueden ser reunidas en una sola cepa, de forma que el efecto acumulativo de estas mutaciones puede ser mayor que el efecto de una sola mutación. Sin embargo, la esperanza inicial de obtener un aumento significativo en el rendimiento por simple recombinación de dos mutantes de alta producción solo ha sido conseguida en unos pocos casos. En la mayoría de los casos, la productividad de los recombinantes generalmente es intermedia entre los valores de las cepas parentales.
• Reemplazo de alelos desfavorables: En el curso del desarrollo de cepas, existe frecuentemente un descenso en el aumento del rendimiento después de cada etapa de mutación. Además de los mutantes que son enriquecidos selectivamente debido a su aumento en la productividad, existe un desarrollo de mutaciones que no se detectan que impiden un aumento adicional en la producción de metabolitos a través de influencias pleiotrópicas. Con cruces genéticos, estos alelos mutantes desfavorables pueden ser reemplazados por alelos de uno de los padres del cruce.
• Mejora de las propiedades de fermentación: Las cepas de alta producción pueden realmente aumentar el coste de la fermentación debido al cambio de las propiedades fisiológicas (mayor producción de espuma, cambio en los requerimientos del medio de cultivo, etc.). Cruzando de nuevo la cepa con la cepa silvestre pueden obtenerse cepas de alta producción con propiedades mejoradas de fermentación.

Manejo de Muestras para Estudios Moleculares

La implementación y realización de las técnicas moleculares debe llevarse a cabo por personal altamente capacitado en el área de biología molecular. Sin embargo, los resultados que se obtengan no solo dependerán de la prueba molecular que se emplee, sino también de la toma y conservación de la muestra de manera apropiada. De este modo, la metodología utilizada, bien sea simple o sofisticada, económica o costosa, no será confiable si no se parte de una muestra manejada de forma adecuada. En general, el personal encargado de la toma, el transporte y del procesamiento de la muestra no es el mismo, por lo que es importante que cada uno de los implicados en el proceso conozca los cuidados y las consideraciones necesarios para evitar resultados erróneos. El manejo de muestras implica tres pasos fundamentales: selección, toma y preservación de la muestra.

Selección de la Muestra

Debe elegirse la muestra que contenga el ácido nucleico de interés. De aquí surgen dos alternativas: estudio de ácidos nucleicos del individuo o detección de ácidos nucleicos exógenos.

La muestra de elección para el análisis de la estructura genómica de un individuo es sangre periférica con anticoagulante; esta contiene glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas. Las únicas células de este tejido que poseen núcleo, y por ende ADN, son los leucocitos, a partir de los cuales es posible extraer ADN genómico. El análisis del ADN de una persona es importante, ya que permite identificar individuos, detectar polimorfismos génicos de predisposición o protección a ciertas enfermedades, analizar mutaciones y establecer el diagnóstico de enfermedades genéticas.

Las técnicas de biología molecular permiten la detección del ADN procedente de cualquier fuente ajena al paciente, como bacterias y virus de ADN, por lo que constituyen una herramienta útil para el diagnóstico molecular de enfermedades causadas por microorganismos. Mycobacterium tuberculosis es un buen ejemplo, ya que es una bacteria de crecimiento lento cuyo diagnóstico mediante cultivo microbiológico puede requerir hasta cinco semanas; mientras que las técnicas moleculares permiten su detección en 24 a 48 horas. Sin embargo, para la identificación de otros microorganismos, el cultivo microbiológico es una herramienta económica, sensible, rápida y específica. Por tal motivo, es recomendable que los estudios moleculares no se apliquen en forma indiscriminada.

La detección de ARN exógeno a través de estudios moleculares es una práctica continua en investigación, y en algunos casos específicos de aplicación clínica. Por ejemplo, la detección y cuantificación del ARN del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y del virus de la hepatitis C (VHC) mediante estudios moleculares suponen una herramienta elemental en el monitoreo de su tratamiento. La muestra de elección dependerá, al igual que en la determinación de ADN, de la historia natural de la partícula viral infectante. Tanto en el caso del VIH como en el del VHC, su historia natural permite establecer que el espécimen adecuado es suero procedente de una muestra de sangre periférica sin anticoagulante.

Toma de la Muestra

En la toma de muestras para estudios moleculares deben considerarse algunos factores y recomendaciones que se mencionan a continuación. Si la muestra es sangre periférica, no es indispensable el ayuno, ya que la ingesta de alimento no modifica la concentración ni la estructura de los ácidos nucleicos; sin embargo, es recomendable el ayuno para evitar que la alta concentración de lípidos de la muestra interfiera con la extracción de los ácidos nucleicos.

Recombinación Genética

La recombinación genética es un proceso que lleva a la obtención de un nuevo genotipo a través del intercambio de material genético entre secuencias homólogas de ADN de dos orígenes diferentes. Las secuencias homólogas de ADN tienen la misma secuencia o casi la misma; por consiguiente, puede ocurrir apareamiento de bases en una longitud extensa de las dos moléculas de ADN. Los cromosomas homólogos tienen los mismos genes ubicados en el mismo sitio. Sin embargo, los genes, aunque similares, pueden no ser necesariamente idénticos, como ocurre cuando existe una mutación en un gen.

Para que aparezcan nuevos genotipos como consecuencia de la recombinación, es esencial que las dos secuencias homólogas sean genéticamente diferentes. Tal es el caso en una célula eucariótica diploide, que tiene dos juegos de cromosomas, uno procedente de cada padre. El punto donde los cromosomas se cruzan se denomina quiasma y el proceso de intercambio se llama entrecruzamiento.

Recombinación Genética en Células Diploides

En las células procariotas solo existe un único cromosoma. Por lo tanto, antes de que pueda ocurrir la recombinación, un cromosoma homólogo (normalmente una parte de este) debe primero ser transferido desde una bacteria donadora a una bacteria receptora. Debido a que el cromosoma del donador debe ser homólogo con el receptor, las bacterias donadoras y receptoras generalmente pertenecen a la misma especie o a especies muy relacionadas.

Recombinación Genética en Bacterias

La recombinación homóloga ocurre después de la transferencia, es decir, cuando el fragmento de ADN del donador está en la célula receptora. Si no se produce recombinación, el fragmento de ADN del donador se perderá, debido a que no puede replicarse independientemente.

Mecanismos de Transferencia Genética en Bacterias

La recombinación genética en bacterias tiene lugar cuando se transfieren fragmentos de ADN homólogo desde una célula donadora a una célula receptora por uno de estos tres procesos:

1. Transformación: supone que el ADN donador se encuentra libre en el medio.
2. Transducción: donde la transferencia del ADN donador está mediada por un virus.
3. Conjugación: donde la transferencia implica un contacto célula-célula y la presencia de un plásmido conjugativo en la célula donadora.

Tecnología del ADN Recombinante

1. Es una cadena de ADN producida artificialmente y formada por la combinación de dos o más secuencias génicas de distintas especies.
2. La tecnología del ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación o inserción en otro diferente.

Enzimas de Restricción (Tijeras Moleculares)

Las enzimas de restricción son endonucleasas (tijeras moleculares) que actúan cortando las cadenas de ADN a través del esqueleto de fosfatos sin dañar las bases.

Son producidas por bacterias como método de defensa contra virus y degradan el ADN extraño.

Plásmidos: Vectores de Clonación

Los plásmidos son pequeñas moléculas de ADN circular presentes en muchas bacterias. Los plásmidos contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorreplicarse, debido a que contienen una cadena de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. Podemos crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido.

Técnicas utilizadas en la tecnología de ADN Recombinante.

Procedimientos de Lisis Celular

La finalidad de la lisis celular es romper las membranas para liberar los ácidos nucleicos para su solubilización en solventes adecuados. En el caso de células con pared celular (ciertas bacterias y células vegetales), se requieren métodos más agresivos que destruyan también la pared celular.

Electroforesis: Principios y Componentes

En biología molecular, una gran cantidad de técnicas que se realizan comúnmente requieren el uso de la electroforesis, por lo que supone una parte importante del procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las proteínas. La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A diferencia de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos nucleicos solo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo; es decir, el ánodo. En el caso de las proteínas se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogenizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo, y solo se separarán por tamaño. El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.

Elementos Clave para la Electroforesis

Para realizar una electroforesis se requiere de una serie de elementos que se describen a continuación:

Cámara de Electroforesis

La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Este campo se genera dentro de una solución amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable al paso de la corriente. La cámara cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía. En las cámaras de electroforesis vertical el polo positivo se encuentra en la parte inferior de la cámara, y en las horizontales, en uno de los extremos. En ambos tipos de cámaras el polo positivo se distingue con color rojo y el negativo con negro.

El Gel (Soporte de Separación)

La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte, con la finalidad de evitar perturbaciones mecánicas durante la separación. El soporte idóneo es un gel semisólido o gelatinoso, compuesto por polímeros que forman una especie de malla o microporos tridimensionales a través de los cuales avanzan las moléculas, según el peso molecular, lo que permite la separación por tamaño de los diferentes componentes de la muestra. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. Para la separación de ácidos nucleicos se usan geles de agarosa o acrilamida y para proteínas, solo de acrilamida.

Geles de Agarosa

La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, que se disuelve fácilmente a una temperatura de 50 a 60ºC, se torna líquida y se solidifica cuando se enfría formando un gel altamente poroso. Para elaborar el gel se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en una solución amortiguadora adecuada de la misma composición y concentración que el buffer de corrimiento y se calienta hasta formar una solución. Sin dejar enfriar se vacía inmediatamente sobre un molde de forma rectangular y en uno de los extremos se coloca un aditamento en forma de peine con la finalidad de generar los pocillos u orificios donde se colocarán las muestras. La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida, ya que no es un compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ácidos nucleicos con pesos moleculares variados, según la concentración de agarosa que se emplee. Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa se escoge según el tamaño del ácido nucleico que se vaya a analizar. El tamaño de los poros de la matriz del gel depende de la concentración de agarosa utilizada y la concentración de agarosa es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido; esto es, a mayor concentración, menor tamaño de los poros, y viceversa, si los poros son pequeños la migración del ácido nucleico es más lenta.

Geles de Acrilamida

La acrilamida es un polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se pueden generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel de poliacrilamida es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. El tamaño de poro de un gel de acrilamida está determinado por la concentración total de acrilamida presente (acrilamida + bisacrilamida), que generalmente se maneja en proporción de 19:1. Regulando la concentración de ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa. Cuando la acrilamida se encuentra en disolución acuosa experimenta autopolimerización de forma espontánea y lenta, con el resultado de que las moléculas de acrilamida se unen cabeza con cola. En presencia de un sistema generador de radicales libres se da una polimerización vinílica en la cual se activan los monómeros de acrilamida, quedan en estado de radical libre y reaccionan rápidamente para formar polímeros de cadena larga. El polímero en disolución no forma un gel, sino que se encuentra en estado viscoso debido a que las cadenas pueden deslizarse unas sobre otras; la formación del gel requiere que varias cadenas queden trabadas (lo que se consigue con la bisacrilamida). La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución. También es esencial almacenarla en un lugar refrigerado, seco y oscuro para reducir la autopolimerización y la hidrólisis.

Buffer de Corrimiento

El buffer de corrimiento es de la misma composición y pH que el buffer con el que se prepara el gel de resolución, ya sea de agarosa o de acrilamida. Este proporciona el medio para la transmisión de la corriente eléctrica y mantiene el pH sin variaciones mientras se realiza el corrimiento. En el caso de los ácidos nucleicos, pueden emplearse TBE o TAE como buffer de corrimiento. El buffer TBE contiene Tris base, ácido bórico y EDTA, y se maneja a un pH de 7.2. El buffer TAE contiene Tris base, ácido acético y EDTA, ajustado a pH 8.5. El buffer de corrimiento de electroforesis de proteínas lleva Tris, 25 mM, SDS al 1% y glicina, 192 mM, a un pH 8.3.

Marcador de Peso Molecular

Son moléculas de ADN o de proteínas que permiten determinar por comparación el tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos o proteínas contenidos en las muestras sometidas a electroforesis. Los marcadores de peso molecular están disponibles comercialmente en amplia variedad. En el caso de marcadores de peso molecular de ácidos nucleicos, estos pueden ser fagos o plásmidos sometidos a corte con enzimas de restricción que generan fragmentos de tamaño definido; también puede tratarse de moléculas de ADN sintéticas denominadas escaleras, porque contienen fragmentos con incrementos de tamaño gradual.

Transiluminador Ultravioleta

El transiluminador transmite luz del espectro ultravioleta a través de la muestra, excitando la molécula cromogénica que emite fluorescencia, lo que permite visualizarla. El transiluminador es el sistema empleado con más frecuencia por ser simple y efectivo. En general, emiten energía a una longitud de onda a 302 nm, aunque también existen para 254 y 365 nm; y suelen contar con un botón para baja/alta intensidades por si se requiere una menor exposición de la muestra a la luz ultravioleta. Algunos también permiten la selección de entre dos longitudes de onda, lo que los hace más flexibles. Los epitransiluminadores (365, 480 nm) generan la emisión visible por fluorescencia igual que el transiluminador pero, a diferencia de este, la fuente de energía se encuentra reflejada y no pasa a través de la muestra. El epi-iluminador es efectivo en geles muy densos.

Buffer de Carga

Este amortiguador tiene como fin brindar peso, densidad y color a la muestra, lo que facilita su depósito en el pocillo y evita su salida del gel; permite, además, monitorear el corrimiento de la muestra en el gel. Se emplea en relación 1:3 para ácidos nucleicos o 1:6 para proteínas, respecto a la cantidad de muestra.

Procedimiento General de una Electroforesis

A continuación, se exponen los pasos de los que consta una electroforesis típica:

1. Preparar un gel de agarosa o acrilamida a la concentración requerida.
2. Mezclar las muestras a analizar con un buffer de carga adecuado.
3. Cargar las muestras en el gel.
4. Realizar la corrida electroforética al voltaje pertinente.
5. Visualizar los ácidos nucleicos.