Virus

Retrovirus

Componentes

Gag

Núcleo y proteínas de la cápside

Pol

Transcriptasa inversa, proteasa, integrasa

Env

Glicoproteínas

Genes reguladores

Tax y Tat (HTLV, HIV-I)

Transactivación de genes virales y celulares

Rex y Rev

Regulación del empalme de ARN y promoción de la exportación al citoplasma

Genes accesorios

Nef

Progresión de seriales, activación celular, progresión para SIDA

Vif

Infectividad del virus, promueve el ensamblaje

Vpu

Facilitación de la liberación de los virus

Vpr

Transporte de ADN complementario al núcleo, deterioro celular

LTR

Promotor

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Aplicaciones

• Cuantificación de la expresión de genes
• Verificación de array
• Control de calidad y validación de ensayos
• Bioseguridad y pruebas de estabilidad genética
• Eficacia de la terapia con drogas/monitoreo de drogas
• Cuantificación viral
• Detección de patógenos
• Medición del daño al DNA (inestabilidad de microsatélites)
• Efecto de la exposición a radiaciones
• Procesos celulares in vivo
• Estudios en ADN mitocondrial
• Detección de patrones de metilación
• Detección de inactivación en el cromosoma X
• Aplicaciones diversas en el diagnóstico clínico, biodefensa, forense y secuenciamiento de ADN

Ventajas

• Es capaz de detectar hasta un cambio de dos veces el contenido
• Se confirma la amplificación específica por una curva de desnaturalización o melting
• Es más específico, sensible y reproducible

Desventajas

• Variaciones intra e interensayos
• Fragilidad o labilidad del ARN
• Puede haber contaminación con DNA

SYBR Green

Ventajas

• El ensayo no requiere del uso de sondas específicas. Detección de miles de moléculas
• Selección general de transcritos antes de realizar ensayos con sondas
• Cuando el PCR está completamente estandarizado, no hay formación de dímeros o presencia de amplicones inespecíficos. Ejemplo cuando se usa ADN genómico

Desventajas

• Ensayos de discriminación de alelos
• Reacciones múltiples (no absolutas)
• Amplificación de transcritos raros
• Baja detección de patógenos

TAQMAN

Consideraciones de diseño de sondas

• Tm igual (58 – 60 °C)
• 15 – 30 bases de longitud
• Contenido de G+C 30 – 80%
• No se ejecuta de cuatro o más Gs (cualquier nucleótido)
• No más de dos de G + C en el extremo 3 ‘
• No G en el extremo 5′ (A, C se prefiere)
• Tamaño del amplicón 50 – 150 pb (máx. 400)
• Span exon-exon junctions in cDNA

Marcadores Moleculares

Microsatélites (MM)

Ventajas

• Alto nivel de polimorfismo
• Fácil acceso en función a costos, facilidad y rapidez
• Alta reproducibilidad
• Ocurrencia frecuente en el genoma
• Que la técnica sea automatizable
• Altamente informativo

RAPD (Polimorfismo de ADN Amplificado al Azar)

Ventajas

• Es altamente sensible
• Sólo se requiere pequeñas cantidades de ADN
• No se necesita conocer la secuencia del ADN en estudio
• Se puede evitar el uso de materiales radiactivos
• Se realiza con mucha facilidad y muy rápidamente
• Tiene un bajo costo

Desventajas

• Es poco reproducible (entre laboratorios)
• Por lo general no permite registrar individuos heterocigotos
• Es dominante
• Localización genómica desconocida

AFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados)

Ventajas

• Necesita poco material de ADN
• Facilidad de diferenciar polimorfismo
• Es altamente reproducible
• Rápido, preciso y reproducible
• La técnica es automatizable

Desventajas

• Es dominante
• Localización genómica desconocida
• Alto costo en los equipos

VNTR (Repeticiones en Tándem de Número Variable)

También conocidos como repeticiones en tándem de número variable, la unidad repetida es de hasta 25 pb de longitud. Marcadores basados en hibridación de sondas. Ubicados en regiones centroméricas y teloméricas de los cromosomas. Están constituidos por un número variable de secuencias idénticas repetidas. Estas poseen de 15 a 100 pares de bases y están repetidas hasta 50 veces. Por este método se pueden detectar gran polimorfismo, que depende de la variación en la distribución de los sitios de restricción y el número de secuencias repetidas.

STR o SSB (Repeticiones Cortas en Tándem o Sitios de Unión Específicos)

Secuencia de 2 a 6 pb, normalmente 4. Por ejemplo, la secuencia ACTTACTTACTT … ACTT puede aparecer repetida 8 veces en un locus y 12 veces en otro locus.

Comparación de Marcadores Moleculares

Aplicaciones de los Marcadores Moleculares

• Identificación de paternidad
• Identificación y protección de variedades
• Certificación de pureza genética en la producción de híbridos
• Monitoreo de fecundación cruzada y autofecundación
• Evaluación de germoplasma y poblaciones de mejoramiento

Isoelectroenfoque

Procedimiento

1. Resolubilizar las proteínas precipitadas en 125 µl de tampón de rehidratación (7M Urea, 2M tiourea, 4% w/v CHAPS, IPG tampón 0.5% (v/v), 3 mg/ml DTT, 0.002% azul de bromofenol) por agitación constante de 1 hora a temperatura ambiente.
2. Luego, centrifugar las muestras a 13000 rpm por 10 minutos para remover el material insoluble.
3. Cuantificar las proteínas siguiendo el procedimiento descrito previamente. La muestra debe contener entre 50 a 200 µg de proteína.
4. Colocar el sobrenadante obtenido sobre uno de los carriles de focalización.
5. Retirar la tira IPG (7 cm) de congelación a -20 °C y colocarla con pinzas sobre el respectivo carril. Dejar humedecer por 2-3 minutos con la solución de proteína.
6. Luego, agregar 1-2 ml de aceite mineral para evitar evaporación y finalmente colocarlo en el equipo de isoelectroenfoque (PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad).
7. Programar el equipo con los siguientes pasos:

Finalizado el protocolo, retirar las tiras de los carriles y lavarlas cuidadosamente con agua destilada para remover el aceite. Luego tratar las tiras con DTT para su completa reducción, sumergiéndolas en 2.5 ml de tampón de equilibrio + 10 mg/ml DTT (6M urea, 75 mM Tris-HCL pH 8.8, 29.3% v/v Glicerol, 2% w/v SDS, 0.002% azul de bromofenol). Agitar las tiras suavemente por 10 minutos a temperatura ambiente y descartar cuidadosamente el tampón utilizado. Luego sumergir las tiras en tampón de equilibración + 25 mg/ml de lodoacetamida (IAA) y colocar en agitación en temperatura ambiente por 10 min para permitir la alquilación de proteínas. Las tiras deben ser enjuagadas cuidadosamente y luego ser colocadas en las cámaras de gel de acrilamida para iniciar la segunda dimensión.