Inmovilización de Enzimas
Los procesos catalizados por enzimas presentan ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
- Gran actividad catalítica.
- Gran especificidad de sustrato.
- Activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.
Aspectos Generales
Se localiza a la enzima en una región definida del espacio para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y pueden ser reutilizadas.
Definición
Es el proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de las enzimas por su unión a un soporte.
Ventajas e Inconvenientes
Ventajas:
- Aumento de estabilidad.
- Reutilización del derivado.
- Reactor de fácil manejo y control.
Inconvenientes:
- Alteración de la conformación del estado nativo.
- Heterogeneidad del sistema enzima-soporte.
- Pérdida de actividad enzimática.
- Biocatalizador más caro que la enzima libre.
Tipos de Tanques (Reactores)
- Agitado.
- Agitado y alimentado continuo.
- Lecho fluidizado y alimentación continua.
- Lecho empaquetado y alimentación continua.
- Lecho empaquetado continuo y reciclado.
- Agitado con alimentación continua y recuperación por ultrafiltración.
Métodos de Inmovilización
Se dividen principalmente en retención física y unión química.
1. Retención Física
Se divide en atrapamiento e inclusión en membranas.
Atrapamiento
Consiste en la retención de la enzima en cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida por prepolímeros fotoentrecruzables.
Método:
- Suspensión de la enzima en una solución del monómero (la enzima queda atrapada en el interior de un gel).
- Polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico (quedando ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética).
Inclusión en Membranas
Se divide en:
Microencapsulación:
Las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de la enzima.
Reactores de Membrana:
Emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial, e impermeables a la enzima.
Métodos:
- Mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana.
- Por contacto continuo de una solución de enzima con la membrana.
2. Unión Química
Se divide en unión a soportes y reticulado, que son los métodos más utilizados y de los que se dispone de una mayor información.
Finalidad:
- Incrementar la afinidad por el sustrato.
- Disminuir la inhibición.
- Optimizar el pH óptimo.
- Reducir la contaminación microbiana.
Tipos de Soporte
Soportes Inorgánicos:
Pueden ser:
- Naturales: arcillas, piedra pómez y sílice.
- Materiales manufacturados: óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado.
Soportes Orgánicos:
- Naturales:
- Polisacáridos: celulosa, almidón, dextranos.
- Proteínas fibrosas: colágeno, queratina.
- Sintéticos: poliolefinas, polímeros acrílicos.
Unión a Soportes
Se divide en:
Adsorción:
La enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrógeno.
Factores que influyen:
- pH del medio.
- Fuerza iónica.
- Diámetro de poro.
- Presencia de iones.
Ventajas:
- Preparación sencilla.
- Bajo costo.
- Sin cambios en la especificidad enzimática.
Inconvenientes:
- Necesidad de optimización de variables.
- Derivados mecánicamente poco estables.
- Unión al soporte débil.
Unión Covalente:
Es el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial.
Finalidad:
Se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De los 20 aminoácidos que tiene la estructura de la enzima, solo la lisina, cisteína, tirosina e histidina se encargan de formar enlaces con el soporte.
Ventajas:
- Manipulación de derivados sencilla.
- Carga enzimática constante después de la inmovilización.
- Los derivados pueden utilizarse en reactores continuos.
- Mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, pH y disolventes.
Inconvenientes:
- Es necesario conocer la densidad de grupos activos, ya que condiciona el número de uniones.
- Puede alterar la estructura del centro activo.
- No es aconsejable para enzimas sensibles a cambios de pH o fuerza iónica.
Reticulado (Cross-linking)
También denominado entrecruzamiento, es una técnica utilizada en la estabilización de muchas enzimas.
Finalidad:
Consiste en el uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima (como dialdehídos, diiminoésteres y diisocianatos).
Resultado:
El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
Co-reticulado:
Permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales.
Finalidad:
Consiste en el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (como la albúmina bovina).
Efectos de la Inmovilización
Produce cambios en su estabilidad. Factores como el pH, sustrato, productos, inhibidores, cofactores y activadores están en la interfase, por lo cual la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional, estérico o del microentorno.
Efectos en la Estabilidad
El incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización se debe a:
- Una estabilización conformacional.
- Protección frente a proteasas del medio.
- Prevención de la agregación intermolecular.
- Alteración del microentorno.