Métodos de Clonación Molecular

La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante. El proceso implica:

1. La inserción del fragmento de ADN que se quiere amplificar en un vector.
2. La introducción del vector recombinante en una célula hospedadora.
3. La selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante.
4. La recuperación del fragmento amplificado.

Ventajas

• Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.
• Se pueden clonar secuencias de ADN de gran tamaño, dependiendo del vector utilizado.
• En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo.
• Permite la creación de librerías genómicas.
• Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés, lo cual es muy útil en la producción de proteínas, hormonas, en investigación, en agricultura o para la obtención de organismos transgénicos y terapia génica.

Comparación PCR / Clonación

• Técnica: in vitro frente a in vivo.
• Réplica: El fragmento de ADN se replica en un tubo de ensayo frente a su introducción en una célula viva.
• Automatización: Técnica automatizada (horas) frente a técnica manual (días).
• Rendimiento: Cantidades de secuencia limitadas por el número de ciclos (25-40) frente a cantidades ilimitadas de secuencia.
• Amplificación: Niveles de amplificación menor frente a la posibilidad de amplificar secuencias de millones de pares.

Vectores de Clonación

Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden replicarse automáticamente en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN extraño, sin perder esa capacidad de replicación autónoma. Actúan como vehículos de clonación, transportando los fragmentos de ADN que se quieren clonar al interior de células huésped, donde se van a replicar. El fragmento de ADN de interés que se introduce en el vector de clonación recibe el nombre de inserto.

Características

1. Tienen un origen de replicación.
2. Tienen, al menos, un sitio de inserción de ADN extraño, que son secuencias diana de enzimas de restricción, presentes una única vez en toda la molécula. Algunos vectores tienen todas las dianas de restricción en un segmento corto del vector (polylinker).
3. Contienen algún marcador de selección que permita distinguir las células que portan el vector de aquellas que no lo portan (genes de resistencia a antibióticos o genes que codifican enzimas que no tiene de manera natural la célula huésped).
4. Contienen un marcador de identificación.
5. Los vectores de expresión contienen un promotor que posibilita la transcripción del inserto y su posterior traducción a proteína.

Tipos

Se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los distintos elementos que lo integran y el tamaño del fragmento de ADN extraño que pueden incorporar:

1. Plásmidos: Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación. Los plásmidos más utilizados son pBR322 y pUC18.
2. Fagos (bacteriófagos): Virus que infectan bacterias. Una vez que el fago introduce su material genético, se adueña del control de la maquinaria metabólica de la célula infectada y desarrolla un ciclo lítico.
3. Cósmidos: Vectores híbridos construidos con las secuencias cos del fago λ y el origen de replicación de un plásmido bacteriano, un gen de resistencia a antibióticos y un polylinker. Admiten insertos de hasta 50kb.
4. Fagémidos: Vectores híbridos compuestos por un plásmido (con su origen de replicación bacteriano) al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13.
5. Cromosomas artificiales: Vectores de clonación con capacidad para transportar fragmentos de gran tamaño. Son idóneos para la construcción de genotecas genómicas porque permiten clonar fragmentos de ADN de gran tamaño con gran estabilidad. Los más utilizados son los Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) y los Cromosomas Artificiales de Levaduras (YAC).
6. Vectores lanzadera: Vectores híbridos que contienen orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes, normalmente uno de plásmido bacteriano y otro de levadura o de virus animal, como el SV40.

Células Hospedadoras

Son aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación. Se cultiva la célula hospedadora con el vector en medios adecuados en los que se multiplica, dando lugar a una progenie de células hijas, todas con la misma carga genética; es decir, un clon. La elección de la célula hospedadora depende del vector de clonación empleado y de la finalidad perseguida.

Tipos de Hospedadores

1. Células procariotas (bacterias): La bacteria más usada en clonación es la cepa K12 de E. coli.
2. Células eucariotas: Levaduras, células vegetales y células animales.

Fases del Proceso de Clonación

1. Creación de un vector recombinante: Para su creación es necesario preparar el ADN que se va a clonar y el vector de clonación, de manera que ambos puedan unirse mediante una ligasa. Para ello, es necesario crear extremos cohesivos y complementarios en los extremos de ambas moléculas. La preparación del vector de clonación consiste en digerirlo con la misma enzima de restricción que se utilizó para preparar el ADN que se va a clonar.
   • A. Inserción del ADN extraño en el vector.
2. Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora: Existen varios métodos para introducir el vector recombinante en células hospedadoras vivas, dependiendo del tipo de vector y de célula empleada. Los más habituales son:
   • A. Transformación bacteriana.
   • B. Transfección.
   • C. Transducción.
   • D. Electroporación.
3. Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés:
   • A. Genes de resistencia a antibióticos.
   • B. Enzimas que producen reacciones coloreadas.
   • C. Proteínas fluorescentes.
   • D. Genes letales.
4. Tasa de transformación: Mide la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora. Matemáticamente se expresa como:
   (UFC * VT) / (C * VS)
   
   • UFC: Unidades formadoras de colonias que crecen en la placa.
   • VT: Volumen total de la solución en el que se realiza la transformación (µL).
   • C: Cantidad del vector empleado, mezcla que incluye vector recombinante y vector no recombinante (µg).
   • VS: Volumen de suspensión bacteriana transformada utilizada para sembrar una placa de medio de cultivo sólido con antibiótico.

Bibliotecas de ADN

Una biblioteca o librería de ADN es una colección de vectores recombinantes clonados cuyas secuencias de ADN extraño se han obtenido de un único organismo.

Tipos de Bibliotecas

1. Bibliotecas genómicas: Colecciones de vectores recombinantes clonados que incluyen el genoma completo de un organismo. Se suelen usar vectores de alta capacidad para intentar contener el genoma completo en el menor número de clones. Se suelen realizar en fagos, cósmidos, BAC o YAC.
2. Bibliotecas cromosómicas: Construidas a partir de un único cromosoma o fracción cromosómica. Se fabrican partiendo de un único cromosoma en metafase, bien por microdisección, centrifugación en gradiente de densidad o citometría de flujo.
3. Bibliotecas de ADNc: Se obtienen a partir del ARNm de un tejido o una población celular determinada, previa transcripción inversa con una retrotranscriptasa. Cada clon porta un gen completo, pero su secuencia difiere de la secuencia genómica de ese mismo gen, puesto que carece de intrones, promotores y secuencias reguladoras.

Análisis

Hay que realizar tres pasos principales:

1. La identificación del clon o clones que contienen un gen o una secuencia concreta.
2. El paseo cromosómico o identificación de clones que porten secuencias consecutivas.
3. La secuenciación.

Aplicaciones de la Clonación Molecular

1. Investigación básica: Herramienta imprescindible para descifrar las secuencias génicas completas de cualquier organismo, para estudios filogenéticos, de diversidad y expresión génica.
2. Investigación aplicada: Destaca la clonación en vectores de expresión y la formación de transgénicos.
3. Medicina: Creación de ratones transgénicos y terapia génica.