PCR técnica in vitro de amplificación de ADN q permite obtener millones de copias = de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.
Cebadores: oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flaquean el fragmento que se quiere amplificar (35F, 53R), fijan la especificidad de la reacción.
AND polimerasas termoestables: enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas con actividad polimerasa a T! –> realizan su actividad polimerasa a una T entre 70 y 75, tienen capcidad de mantener su actividad polimerasa a 95ºC. Pueden ser: actividad exonucleasa 53 pero sin actividad exo 35 (no corregir errores no eliminar nucleótidos mal), actividad exo 53 y 35 (actividad correctora elongación de la cadena), actividad transcriptasa inversa (iones magnesio sintetizar y aplificar ADNc a partir de ARN).
Ciclo: desnaturalización (!Larga!T: 94-95ºC durante 15-30s) hibridación (50-65ºC durante 30-60s: T! Mayor rigurosidad, mayor especificidad pero rendimiento menor; T¡ mayor rendimiento pero productos no deseados) extensión (T de polimeración de la enzima Taq polimerasa 72ºC, está condicionado por la v de polimeración de la enzima y de la longitud del fragmento y para enzimas correctoras T de extensión !).
1r: desnaturalización (se separan las 2 cadenas nativas), hibridación (cebador se une a diana), extensión (sintetiza dos nuevas cadenas pero cn longitud!), resultado: 2 prodctos no deseados y 0 deseados. 2n: desnaturalización (se disocian obteniendo 4 cadenas), hibridación y extensión (cuatro nuevas cadenas), resultado: 4 productos no deseados y 0 deseados. 3r: desnaturalización (8 hebras molde), hibridación y extensión (8 hebras a 8 heterodúplex), resultado: 6 productos no deseados y 2 amplicones. 4t: desnaturalización (16hebras), hibridación y extensión (16 hebras dan lugar a 16 heterodúplex), resultado: 8 productos no deseados y 8 amplicones.
PCR estándard se amplifica un único fragmento de adn, con un único 2 de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final. La mezcla de reacción: todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada (cloruro magnesio: las adn polimerasas termoestables requieren iones de magnesio como cofactor para desarrollar su actividad, desoxinucleótidos trifosfato: 4 desoxi que componen las moléculas de adn en forma de desoxi trifosfato para que la adn polimerasa pueda usarlos como sustrato para incorporarlos a las cadenas en crecimiento, cebadores: son claves para realizar una amplificación específica con éxito, and polimerasa: reactivo clave para realizar una pcr con éxito, adn molde: contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar (calidad: alto grado de integridad, coeciente a260/a280 entre 1,7 y 2, libre de contaminantes; cantidad: la cantidad idónea para obtener los mejores resultados en una pcr dependerá de la complejidad del adn que se estudia), otros aditivos: en ocasiones el rendimiento de la pcr es ¡ o aparecen productos no deseados.
Preparación de muestras: ajuste del volumen de reacción (volumen final: la diferencia entre la suma d los volúMenes de cada componente y el volumen final de la mezcla de reacción se completa con agua estéril grado pcr), mezcla máster (incluye todos los componentes menos el adn molde), control positivo (tubo con mezcla se añade adn molde control q contiene el fragmento q se amplifica) y control negativo (tubo con mezcla en el q se sustituye el adn molde por un volumen = de agua, no hay adn en la reacción). Programación: 1: desnaturalización inicial (94-95 completa desnatura de todas las moléculas bicatenarias de adn presentes); 2: ciclos de replicación se programa: T y tiempos de incubación y el número de ciclos de replicación; 3: extensión final (incubación única ala T óptima d polimerización de la adn polimerasa. 4: mantenimiento (incubación a 4º sin límite). Análisis de los productos amplificados.
Pcr con inicio caliente: evitar la actividad de la enzina a bajas T (preparando la mezcla sin adn polimerasa: engorrosa y contaminación / aislando la adn polimerasa del resto de componentes: adn polimerasa en el interior de esferas de cera, cuando se calientan se funde la cera y la enzima se libera / suministrando adn polimerasa inactiva: bloqueándola con un anticuerpo específico)
Pcr de grandes fragmentos (mezcla de and polimerasas: sin actividad correctora y con actividad correctora / uso de aditivos: glicerol (estabiliza las adn polimerasas), DMSO (desnaturalización) / concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción (concentraciones ¡ de potasio favorecen la eficiencia de la amplificación de fragmentos largos)
Pcr de alta fidelidad: evitar introducir en los amplicones mutaciones puntuales como incorporación de nucleótidos erróneos (adn polimerasas termoestables con actividad correctora / ph / in exceso del ion magnesio suele disminuir la fidelidad de las polimerasas.
Pcr anidada: realización de dos reacciones de pcr acopladas, de manera q la segunda utiliza como adn molde los productos de amplificación de la primera (cebadores externos en la primera pcr y cebadores internos)
Pcr múltiple: amplificación de varias secuencias diana simultániamente, en el mismo tubo, en una sola reacción de pcr (juego de cebadores específicos: la T de todos los cebadores debe ser similar, los amplicones tamaño diferente para poder separarse en la electroforesis y deben diseñarse para q no puedan hibridar unos con otros)
RT-PCR: amplificar y analizar moléculas de arm (1: síntesis de adnc por una RT y 2: and polimerasa termoestable utiliza adnc como molde) –> mezcla hexanucleótidos transcriben todo el arn de la muestra de adnc, usar como cebador un oligo-dT se transcriben a ADNc todas las moléculas de arnm y un cebador específico se transcribe a adnc un fragmento de arn q contiene la secuencia q queremos amplificar).
Pcr a tiempo real: se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera q la detección de amplicones se realiza ciclo a ciclo (!Rapidez en la detección cualitativa, resultados más fidedignos, minimiza contaminación, permite la cuantificación de los amplicones producidos).
Curva de amplificación: tipo sigmoide q se obtiene al representar la emisión de fluorescenia en cada ciclo de pcr respecto del nímero de ciclo en q se produce (fase de ruido: señal fluorescente de fondo de cada tubo; fase de crecimiento exponencial: producción de amplicones; fase de meseta: disminución del rendimiento.
Sistemas de detección de amplicones: independientes de secuencia (empleo de agentes fluorescente intercalantes) detección específicos de secuencia (sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos q hibridan de manera específica en la regíón central del amplicón. Aplicaciones de la pcr a tiempo real: pcr cuantitativa a tiempo real y la detección de mutaciones mediante curvas de fusión).