T11. Microbiología y Microorganismos

Definiciones Fundamentales

Microbiología: Ciencia biológica que estudia los microorganismos. Estudia la estructura, función, desarrollo, metabolismo, genética, comportamiento, ordenación taxonómica y evolución de los microorganismos, así como las actividades microbianas para su explotación y control.

Microorganismos: Entidad biológica acelular u organismo unicelular, pluricelular o cenocítico, carente de organización tisular, para cuyo estudio se requiere la metodología del cultivo puro y que, por su tamaño, escapa a la percepción del ojo humano.

Diversidad del Mundo Microbiano

• Entidades acelulares: Virus, viroides y priones.
• Procariotas: Bacterias y arqueas.
• Eucariotas: Hongos, algas y protozoos.
• Animales microscópicos: Planarias (gusanos planos), ácaros, crustáceos, nemátodos (gusanos redondos), rotíferos, tardígrados.

Ramas de la Microbiología

• Ciencia básica: Taxonomía, Filogenia, Citología, Fisiología, Bioquímica, Ecología, Genética.
• Ciencia aplicada: Microbiología médica y sanitaria, de los alimentos, agrícola y ganadera, ambiental, industrial, biotecnológica.

Importancia de los Microorganismos

1. Formas de vida más antiguas: Bacterias (3800 Ma), Bacterias fotótrofas anoxigénicas, Cianobacterias. La vida fue exclusivamente microbiana hasta hace aproximadamente 1000 millones de años.
2. Distribución muy amplia: Presentes en casi cualquier ambiente.
3. Constituyen la mayor porción de biomasa en la Tierra: Son los reservorios más importantes de nutrientes esenciales para la vida (C, N, P).
4. Principales responsables del mantenimiento de la vida: Seres vivos que más contribuyen en el mantenimiento de ciclos biogeoquímicos (ej. fijación del nitrógeno).
5. Efecto sobre los seres humanos:
   • Beneficiosos: Protegen de enfermedades, producen alimentos, bebidas, antibióticos, vitaminas. Son una fuente extraordinaria de información para el conocimiento de procesos biológicos (simplicidad estructural, tasa elevada de crecimiento, fácil manipulación genética, alta capacidad para realizar transformaciones químicas). Herramientas muy útiles para solucionar problemas de salud, ambientales y económicos de la sociedad actual. (Ej: Saccharomyces cerevisiae, Acetobacter aceti, Rhizobium).
   • Perjudiciales: Causan enfermedades, deterioran productos y materiales de interés. (Ej: Escherichia coli, Toxoplasma gondii, Acanthamoeba histolytica).

Microbiota: 3,8 x 10¹³ microorganismos en nuestro cuerpo. Microbiota intestinal ≈ 100 billones.

Principal Microbiota Normal del Ser Humano

• Conjuntiva: Staphylococcus aureus
• Oído externo: Pseudomonas
• Boca y orofaringe: Estreptococos beta-hemolíticos, Staphylococcus aureus
• Intestino Delgado: Lactobacillus spp.
• Intestino grueso: Lactobacillus spp., Candida spp.
• Vagina: Lactobacillus spp., Candida spp.
• Uretra: Streptococcus spp.
• Piel: Staphylococcus aureus
• Estómago: Lactobacillus
• Nariz: Staphylococcus aureus

Mayor procariota conocido: Thiomargarita magnifica (hasta 2 cm), única célula larga y filamentosa con ADN en pequeños paquetes ordenados.

Taxonomía Microbiana

Ciencia que clasifica los microorganismos en grupos o taxones de acuerdo con sus semejanzas fenotípicas, genotípicas y filogenéticas.

Taxones (Linneo, s. XVIII): Especie, Género, Familia, Orden, Clase, Filo, Dominio.

Dominio: Taxón de orden superior al Reino. Cada una de las 3 líneas celulares filogenéticamente distintas en las que se incluyen todos los seres vivos, basándose en la comparación de secuencias de los ARNr 16S (Procariotas) y 18S (Eucariotas).

Especie procariota: Conjunto de cepas que presentan un alto grado de similitud en rasgos fenotípicos, genotípicos y filogenéticos independientes. Los rasgos fundamentales para agrupar cepas en una especie son: hibridación ADN-ADN de al menos el 70% y parecido de secuencia en el gen del ARNr 16S de al menos el 97%.

Cepa: Población de células de una especie descendientes de una única célula (clones).

Carl Woese: Revolucionó la sistemática y filogenia comparando secuencias de ARNr de distintas clases de organismos procariotas y eucariotas. Los resultados mostraron que se agrupaban en 3 grupos celulares diferentes: eucariontes y dos tipos diferentes de procariontes, bacterias y arqueas (Dominios independientes).

División de los seres vivos en 3 dominios:

• Bacteria: Con peptidoglicano.
• Archaea: Sin peptidoglicano.
• Eukarya: Animales, plantas, hongos, protistas (algas y protozoos).

Estructura y Función de la Célula Procariota

Comparación entre Bacterias y Arqueas

• Características comunes: Tamaño y forma similares, unicelulares, gran diversidad metabólica, reproducción asexual, cosmopolitas.
• Diferencias: Historia evolutiva, crecimiento en hábitats extremos (más común en arqueas), patogenicidad (no descrita en arqueas), arqueas no producen endosporas ni son fotosintéticas, estructura molecular (membrana plasmática y pared celular).

Membrana Plasmática

• Dominio Bacteria: Hopanoides (similares a esteroles), fosfolípidos con enlace éster.
• Dominio Archaea: Polímeros de isopreno (fitano, bifitano), fosfolípidos con enlace éter. No hopanoides, algunos tienen esteroles.

Características generales: Contenido proteico elevado; superficie interna hidrófoba, partes externas hidrófilas; proteínas integrales y proteínas periféricas de membrana.

Funciones:

• Barrera de permeabilidad: Evita pérdidas y funciona como puerta de entrada de nutrientes y salida de desechos y enzimas.
• Anclaje de proteínas: Procesos de transporte, bioenergética, quimiotaxis y fototaxis.
• Generación de energía: Sitio de generación y uso de la fuerza motriz de protones (generada por el movimiento de protones a favor de un gradiente electroquímico) para transporte, rotación del flagelo, etc.

Pared Celular

• Dominio Bacteria:
  • Gram positivo: Gruesa capa de peptidoglucano, ácidos teicoicos y lipoteicoicos, periplasma delgado, membrana plasmática (MP).
  • Gram negativo: Membrana externa (con lipopolisacárido – LPS, que contiene lípido A, core y antígeno O; porinas, lipoproteínas), fina capa de peptidoglucano en el periplasma, membrana plasmática (MP).
  • Peptidoglicano: Polímero formado por N-acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico unidos por enlace β(1-4), con cadenas peptídicas entrecruzadas.
• Dominio Archaea: Diversidad de paredes. Algunas tienen pseudopeptidoglicano, otras heteropolisacáridos (tiñen como Gram positivas) o capas S de proteínas/glucoproteínas (tiñen como Gram negativas). No contienen peptidoglicano.

Funciones de la pared celular:

• Confieren rigidez y mantienen la forma celular.
• Protege frente a la lisis osmótica.
• Contribuye a la patogenicidad (Bacterias Gram negativas: Lípido A del LPS = endotoxina; Gram positivas: Ácidos teicoicos = adhesinas).
• Diana de agentes antimicrobianos: Desinfectantes y antibióticos (ej. penicilina inhibe la síntesis de peptidoglicano).

Notas adicionales sobre membranas:

• Bacterias que carecen de esteroles (y pared): Micoplasmas.
• Algunas bacterias como cianobacterias y metanótrofas contienen esteroles o hopanoides.
• Las arqueas usan isoprenoides (fitano, bifitano) en lugar de ácidos grasos en sus lípidos de membrana, unidos al glicerol por enlace éter.

Estructuras Externas a la Pared Celular

• Cápsula y Capa Mucosa (Glicocálix): Capa de material viscoso y pegajoso (generalmente polisacáridos, a veces proteínas) que rodea la pared celular de algunos procariotas. Si está organizada y es rígida, se llama cápsula (impermeable a algunos colorantes como la nigrosina); si es laxa y difusa, capa mucosa.
  • Funciones: Adhesión a superficies y células hospedadoras (patógenos); Protección (desecación, fagocitosis, agentes antimicrobianos); Movilidad (bacterias deslizantes).
• Fimbrias y Pili: Apéndices filamentosos rectos y rígidos de naturaleza proteica, insertados a nivel de la membrana plasmática, habituales en bacterias Gram negativas.
  • Funciones: Adhesión a superficies y entre células; Pili sexuales: implicados en la conjugación bacteriana; Pili tipo IV: implicados en movimiento por tirones (twitching motility).
• Flagelos: Largos apéndices filamentosos helicoidales rígidos, insertados a nivel de la membrana plasmática, responsables del movimiento en medios líquidos.
  • Función: Desplazamiento en medios líquidos de la mayoría de procariotas móviles.
  • Disposición: Polar (monotrico: uno solo; lofotrico: penacho en un polo; anfítrico: uno o penacho en ambos polos) y peritrico (distribuidos por toda la superficie).

Estructuras Internas

• Nucleoide: Región irregular dentro del citoplasma que alberga el material genético principal. En general, los procariotas poseen un único cromosoma circular de doble hélice de ADN (aunque hay excepciones lineales o con múltiples cromosomas). No está rodeado por membrana.
• Plásmidos: Moléculas de ADN extracromosómico, generalmente circulares (a veces lineales), que se replican y transcriben de manera independiente al cromosoma. Son generalmente dispensables (no esenciales para la vida).
  • Funciones: Confieren propiedades adaptativas y de mejora (resistencia a metales pesados, antibióticos; nuevas capacidades metabólicas y anabólicas; factores de virulencia; conjugación).
• Ribosomas: Partículas citoplasmáticas compuestas por ARNr y proteínas, cuya función es la síntesis de proteínas. En procariotas son de 70S.
  • Subunidad Mayor: 50S (contiene ARNr 23S y 5S).
  • Subunidad Menor: 30S (contiene ARNr 16S).
• Cuerpos de inclusión: Gránulos de material orgánico o inorgánico acumulados por la célula en el citoplasma. Algunos están rodeados por una membrana no unitaria (lipídica o proteica), pero no se consideran orgánulos.
  • Funciones:
    • a) Disponer de nutrientes de reserva: Orgánicos (Polisacáridos como glucógeno o almidón, Lípidos como poli-β-hidroxibutirato – PHB, Péptidos como cianoficina), Inorgánicos (Gránulos de azufre elemental, Gránulos de polifosfato).
    • b) Compartimentalización de funciones metabólicas: (Carboxisomas: contienen RuBisCO para fijación de CO₂ en el Ciclo de Calvin; Clorosomas: contienen pigmentos fotosintéticos en bacterias verdes).
    • c) Adquirir propiedades que les ayuden a realizar sus funciones vitales: (Vacuolas de gas: proporcionan flotabilidad, son impermeables al agua pero permeables a gases; Magnetosomas: cristales de magnetita que permiten la orientación en campos magnéticos).
• Endospora: Estructura de resistencia diferenciada, de pared gruesa, metabólicamente inactiva y muy resistente al calor, desecación, radiación y agentes químicos. Se forma dentro de algunas bacterias (principalmente géneros Bacillus y Clostridium) ante situaciones adversas, generalmente por falta de nutrientes.
  • Función: Actuar como forma de supervivencia y dispersión, no tiene función reproductora.
  • Localización: Puede ser terminal, subterminal o central dentro de la célula madre.

T12. Evaluación del Crecimiento de los Microorganismos

Definición de Crecimiento Microbiano

Crecimiento: Incremento ordenado de todos los componentes celulares de un microorganismo que tiene como resultado un aumento de tamaño y, finalmente, del número de células (incremento de la población).

Ciclo Celular Procariota y Fisión Binaria

Ciclo celular de un procariota: Conjunto de sucesos que ocurren desde que se origina una célula hasta que se divide para dar lugar a dos células hijas.

Fisión binaria: Mecanismo de reproducción asexual más simple y más ampliamente distribuido en procariotas. Consiste en la duplicación de todos los componentes celulares y la posterior división celular (citocinesis), originando dos células hijas genéticamente idénticas (salvo mutaciones).

Sucesos del ciclo celular procariota (ej. E. coli ~20-40 min en condiciones óptimas):

1. Replicación del ADN: Comienza en el origen de replicación (oriC) y procede bidireccionalmente hasta el término (terC), generando dos cromosomas.
2. Elongación de la célula: La célula aumenta de tamaño mediante la síntesis de nueva pared celular y membrana plasmática. Aumenta el número de todos los componentes estructurales, macromoléculas, monómeros, iones. Comienza la separación de los cromosomas recién replicados hacia los polos celulares.
3. Formación del Septo: Se forma un septo (tabique) de división en el centro de la célula, dirigido por un complejo proteico llamado divisoma. Ocurre la segregación completa de los cromosomas a las futuras células hijas.
4. Separación de las células (Citocinesis): El septo se completa y las dos células hijas se separan.

Ciclo Celular Detallado de Escherichia coli

1. El origen de replicación migra hacia el centro de la célula y se ensambla el replisoma (complejo de replicación).
2. Replicación bidireccional: el ADN se desenrolla al llegar al replisoma, el cual permanece relativamente estático en el centro.
3. Durante la elongación celular, los orígenes de replicación de los nuevos cromosomas se dirigen hacia polos opuestos (participa la proteína MreB, homóloga a la actina eucariota).
4. Se inicia la formación del septo y los cromosomas se separan con la participación de proteínas del complejo que dirige la formación del septo, el divisoma.

Síntesis de Pared y Membrana durante la División

En la fisión binaria se sintetiza membrana y pared celular durante la elongación de la célula y la formación del septo de división.

La localización de la síntesis de membrana y pared varía:

• A) Cocos: La síntesis ocurre principalmente en la zona central donde se formará el septo, expandiéndose hacia afuera.
• B) Bacilos: La síntesis ocurre en múltiples zonas repartidas a lo largo de la célula (dirigida por MreB) durante la elongación, y también en el sitio de formación del septo.

Proteínas Clave en la División Celular

• MreB: Proteína integrante del citoesqueleto de muchas bacterias bacilares (no en cocos). Se agrega formando filamentos helicoidales que rotan por debajo de la membrana plasmática. Homóloga a la actina en eucariotas.
  • Funciones:
    • a) Dirige los puntos de síntesis de peptidoglicano durante la elongación celular de los bacilos (la síntesis se produce en los puntos de contacto de la hélice con la membrana, y la rotación permite que se sintetice pared en todo el contorno).
    • b) Implicada en el mantenimiento de la forma bacilar (su ausencia produce formas cocoides).
    • c) Posible participación en la segregación de los cromosomas nacientes hacia los polos.
• Divisoma: Complejo multiproteico que dirige la formación del septo y la división celular. Se localiza en el centro de la célula.
  • FtsZ: Proteína clave del citoesqueleto de bacterias y arqueas (homóloga a la tubulina eucariota). En la división celular, polimeriza formando un anillo (anillo Z) en el punto medio de la célula después de la replicación del ADN y un poco antes de que termine la elongación. La contracción del anillo Z (utilizando energía de la hidrólisis de GTP) dirige la invaginación de la membrana y la síntesis del septo de división.
  • ZipA y FtsA: Proteínas que anclan el anillo FtsZ a la membrana plasmática. FtsA también es homóloga a la actina.
  • FtsI: Transpeptidasa implicada en la síntesis del peptidoglicano del septo (también conocida como PBP3, Proteína Fijadora de Penicilina 3).
  • FtsK: Proteína implicada en la separación (segregación) de los cromosomas hermanos durante la formación del septo.

Curva de Crecimiento Microbiano en Cultivo Discontinuo (Batch)

Cuando se inoculan microorganismos en un medio de cultivo líquido fresco en un sistema cerrado (sin añadir nutrientes ni retirar productos), la población sigue una curva de crecimiento característica con cuatro fases:

1. Fase de Latencia (Lag): Periodo inicial donde no hay incremento neto del número de células. Es un periodo de adaptación de los microorganismos al nuevo medio y condiciones de cultivo previo al crecimiento activo. Las células pueden estar sintetizando enzimas, cofactores o reparando daños.
   • Causas posibles: Inóculo de células viejas, refrigeradas o congeladas (carecen de componentes esenciales); inóculo de células alteradas o dañadas (por temperatura, radiación, tóxicos); cambio a un medio de cultivo con nutrientes diferentes o más pobre (requiere síntesis de nuevas enzimas).
   • Duración: Variable, desde ausente (si se inocula con células jóvenes en fase exponencial en el mismo medio) hasta muy larga.
2. Fase Exponencial o Logarítmica (Log): Periodo de crecimiento máximo y constante. Las células se dividen a velocidad constante y la población se duplica en periodos de tiempo regulares llamados Tiempo de Generación (g). La velocidad de crecimiento (número de generaciones por unidad de tiempo) es máxima.
   • Características: Las células se encuentran en el estado fisiológico más sano y activo. Son óptimas para estudios bioquímicos y genéticos. La población es muy uniforme. El tiempo de generaciòn (g) y la velocidad de crecimiento (v) dependen de: a) características genéticas del microorganismo, b) la composición del medio de cultivo, c) las condiciones fisicoquímicas de cultivo (Tª, pH, O₂).
   • Matemáticas: El número de células (N) aumenta exponencialmente: N = N₀ * 2ⁿ, donde N₀ es el número inicial de células y n es el número de generaciones. En escala logarítmica, esta fase es una línea recta.
3. Fase Estacionaria: Periodo durante el cual el crecimiento neto de la población es cero. El número de células viables del cultivo permanece constante. Puede deberse a que la tasa de división iguala a la tasa de muerte, o a que cesa el crecimiento neto aunque las células pueden seguir metabólicamente activas (metabolismo energético, procesos biosintéticos como producción de metabolitos secundarios).
   • Causas: a) Limitación de un nutriente esencial (ej. fuente de C, N, O₂ para aerobios). La naturaleza del nutriente limitante puede determinar la duración de esta fase. b) Acumulación de productos de desecho tóxicos (ej. ácidos que cambian el pH, alcoholes). c) Se alcanza una densidad de población crítica (procariotas no filamentosos: ~10⁹ cél/mL; eucariotas: ~10⁶ cél/mL), posiblemente por mecanismos de quorum sensing.
4. Fase de Muerte: Periodo de disminución exponencial del número de células viables en la población.
   • Causas: Agotamiento total de nutrientes, acumulación excesiva de tóxicos, agotamiento de las reservas intracelulares de energía. No se puede generar ATP, no se pueden reparar los daños celulares.
   • Características: La muerte de la población suele ser exponencial (una línea recta descendente en escala logarítmica). La velocidad de muerte suele ser mucho menor que la velocidad de crecimiento exponencial. La velocidad de mortalidad puede disminuir después de reducirse drásticamente la población debido a la existencia de células más resistentes o en estado durmiente (persisters).

Parámetros del Crecimiento Exponencial

• a) Tiempo de Generación (g): Tiempo que tarda una población microbiana en duplicar su número de células. Se calcula como g = t / n (donde t es el tiempo y n el número de generaciones en ese tiempo).
• b) Velocidad de Crecimiento o Tasa de División (v): Número de generaciones por unidad de tiempo. Es la inversa del tiempo de generación: v = n / t ó v = 1 / g.
• c) Número de Generaciones (n): Número de veces que se ha duplicado la población en un tiempo determinado (t). Se puede calcular a partir del número inicial (N₀) y final (N) de células: N = N₀ * 2ⁿ => log N = log N₀ + n * log 2 => n = (log N – log N₀) / log 2 ≈ 3.3 * (log₁₀ N – log₁₀ N₀).

Parámetro de la Fase de Muerte

• Tiempo de Reducción Decimal (D): Tiempo requerido a una determinada condición letal (ej. temperatura) para reducir el número de células viables 10 veces (en un 90%). Se calcula a partir de la pendiente (m) de la curva de muerte en escala logarítmica: D = -1 / m. Es un parámetro importante en esterilización y desinfección.

Medición del Crecimiento Microbiano

Determinación del Número de Células

• a) Recuentos Directos (Número Total de Células):
  • Cámaras de Recuento (ej. Petroff-Hausser, Neubauer): Se cuenta el número de células en un volumen conocido bajo el microscopio. Método sencillo, rápido y barato. Limitaciones: No distingue vivas/muertas, difícil para células pequeñas o móviles (requieren fijación), se pueden confundir restos inertes, no adecuado para cultivos muy diluidos.
  • Contadores Electrónicos de Partículas (ej. Contador Coulter): Las células suspendidas en un electrolito pasan por un orificio y causan interrupciones en una corriente eléctrica, que son contadas. Rápido y preciso para determinar número y tamaño. Limitaciones: No distingue vivas/muertas, no útil para filamentosos o agregados, se confunden partículas inertes, caro.
  • Citometría de Flujo: Similar al Coulter pero usa un haz láser y detectores de luz dispersada y fluorescencia. Puede distinguir vivas/muertas (con tinciones vitales) y diferenciar subpoblaciones. Muy potente pero complejo y caro.
• b) Recuentos Indirectos (Número de Células Viables): Se basan en la capacidad de una célula viable de formar una colonia en un medio sólido.
  • Recuento en Placa (Siembra en Superficie o en Masa): Se realizan diluciones seriadas de la muestra y se siembra un volumen conocido en placas de agar. Tras incubar, se cuentan las colonias formadas (asumiendo que cada colonia proviene de una célula viable o UFC – Unidad Formadora de Colonias). Se expresa en UFC/mL.
    • Ventajas: Solo cuenta células vivas, sensible, ampliamente usado.
    • Limitaciones: Requiere tiempo de incubación, subestima el número real (células en agregados dan una sola colonia, no todas las células viables forman colonia en las condiciones dadas), errores en dilución/pipeteo. Rango óptimo de colonias por placa: 30-300.
    • Cálculo: N (UFC/mL) = (Número de colonias * Factor de dilución) / Volumen inoculado (mL)
  • Filtración por Membrana: Para muestras con baja densidad celular (ej. agua). Se filtra un volumen conocido a través de una membrana estéril con poros pequeños que retienen las bacterias. La membrana se coloca sobre una placa de agar y se incuba. Se cuentan las colonias en el filtro. Mismas ventajas y limitaciones que el recuento en placa.

Determinación de la Masa Celular (Biomasa)

• a) Procedimiento Directo:
  • Peso Seco: Se separan las células del medio (centrifugación o filtración), se lavan, se secan en estufa (ej. 105°C) hasta peso constante y se pesan. Es el método de referencia para biomasa. Limitaciones: Destructivo, laborioso, requiere gran cantidad de células.
• b) Procedimientos Indirectos:
  • Cuantificación de un Constituyente Celular: Se mide la cantidad de un componente celular que se asume proporcional a la masa total (ej. proteína total, ADN total, N total, ATP). Limitaciones: La proporción del componente puede variar con las condiciones de crecimiento, requiere procesar la muestra.
  • Medidas de Turbidez (Densidad Óptica): Se mide la dispersión de la luz por una suspensión celular usando un espectrofotómetro o nefelómetro. La turbidez (absorbancia o densidad óptica – DO) es proporcional al número y masa celular (dentro de un rango). Método muy rápido, sencillo, no destructivo, ideal para seguir el crecimiento en tiempo real.
    • Limitaciones: No distingue vivas/muertas, menos sensible a bajas densidades, no aplicable a filamentosos o formadores de grumos, requiere una curva patrón que relacione DO con número de células viables o peso seco para obtener valores absolutos.

Determinación de Otros Parámetros

• Actividad Metabólica: Medir el consumo de un sustrato (ej. O₂) o la producción de un metabolito (ej. CO₂, ácido, ATP) como indicador indirecto del crecimiento o viabilidad. Ej: Tasa respiratoria.

T13. Observación Microscópica de Microorganismos

Manipulación de Microorganismos: Técnica Aséptica

Técnica aséptica: Conjunto de prácticas y procedimientos utilizados para prevenir la contaminación microbiana no deseada. Es fundamental para:

• Evitar la contaminación de materiales y medios de cultivo estériles.
• Evitar la contaminación de cultivos puros de microorganismos.
• Proteger a las personas que manipulan los microorganismos (especialmente patógenos) y el entorno.

Se aplica a:

• El lugar de trabajo y las personas: Limpieza, higiene y desinfección de superficies, lavado de manos, uso de batas, guantes si es necesario.
• La transferencia de microorganismos:
  • a) Mantenimiento de un entorno estéril: Trabajo cerca de la llama de un mechero Bunsen (crea corriente de aire caliente ascendente estéril), uso de cabinas de flujo laminar (proporcionan aire filtrado estéril sobre la zona de trabajo), uso de cabinas de seguridad biológica (protegen al usuario y al ambiente al manipular patógenos).
  • b) Esterilización de todo el material: Asas de siembra (flameado), recipientes de vidrio y plástico, puntas de pipeta, medios de cultivo, tampones, agua empleada para hacer disoluciones.
  • c) Procedimientos adecuados: Apertura y cierre correctos de los recipientes (ej. flameado de la boca de tubos y matraces antes y después de tomar muestra), manejo estéril de pipetas y asas.

Procedimiento Básico de Toma de Muestra de un Cultivo Líquido en Tubo

1. Esterilización del asa de siembra por flameado hasta el rojo vivo. Enfriar.
2. Apertura del tubo: sostener el tapón con los dedos meñique y anular de la mano que sujeta el asa, sin depositarlo en la mesa.
3. Flameado de la boca del tubo.
4. Toma de muestra introduciendo el asa en el cultivo.
5. Flameado de la boca del tubo nuevamente.
6. Cierre del tubo con el tapón.
7. Siembra de la muestra en el nuevo medio o preparación.
8. Esterilización final del asa por flameado.

Forma, Tamaño y Agrupamiento de los Procariotas

Tipos Morfológicos Principales

• Coco: Forma esférica u ovalada.
• Bacilo: Forma cilíndrica o de bastón.
• Formas curvadas o espirales:
  • Vibrio: Bacilo curvado en forma de coma.
  • Espirilo: Forma helicoidal rígida con flagelos externos.
  • Espiroqueta: Forma helicoidal flexible, con endoflagelos (filamento axial) en el espacio periplásmico que permiten un movimiento característico.

Variaciones Morfológicas

• Con yemas y/o apéndices (prostecas): Ej. Caulobacter.
• Filamentosas: Células que crecen formando largos filamentos. Ej. Actinomicetos, algunas cianobacterias.
• Pleomórficos: Organismos que presentan forma variable, a menudo carecen de pared celular rígida. Ej. Mycoplasma.

Tamaño Celular

• Rango de tamaño de células procariotas: Típicamente entre 0.2 y 5.0 µm de diámetro o anchura. La mayoría de los bacilos miden entre 0.5 y 4.0 µm de ancho y menos de 15 µm de largo.
• Excepciones de pequeño tamaño: Algunas nanobacterias/nanoarqueas: 0.05-0.2 µm de diámetro. Mycoplasma: ~0.3 µm.
• Excepciones de gran tamaño:
  • Oscillatoria (cianobacteria): 8 x 50 µm
  • Epulopiscium fishelsoni (bacteria intestinal pez cirujano): 75 x 600 µm
  • Thiomargarita namibiensis (bacteria marina): hasta 750 µm de diámetro
  • Thiomargarita magnifica (bacteria manglar): hasta 2 cm de longitud (visible a simple vista) – Descrita en 2022.
• Rango de tamaños de células eucariotas: Generalmente mucho mayores, típicamente 10 – 200 µm en diámetro.

Agrupamiento Celular (Según el plano de división)

• Cocos:
  • Diplococo: Pares (división en un plano). Ej. Neisseria.
  • Estreptococo: Cadenas (divisiones sucesivas en un plano). Ej. Streptococcus.
  • Tétrada: Grupos de cuatro (división en dos planos perpendiculares). Ej. Micrococcus.
  • Sarcina: Paquetes cúbicos de ocho o más (división en tres planos perpendiculares). Ej. Sarcina.
  • Estafilococo: Agrupaciones irregulares en forma de racimo (división en múltiples planos al azar). Ej. Staphylococcus.
• Bacilos:
  • Diplobacilo: Pares.
  • Estreptobacilo: Cadenas.
  • (Menos común ver otras agrupaciones complejas).

Microscopía Óptica

Los microscopios ópticos usan luz visible para iluminar las muestras. Los más utilizados en microbiología son:

• Microscopio de campo claro
• Microscopio de campo oscuro
• Microscopio de contraste de fases
• Microscopio de fluorescencia

Microscopio Óptico de Campo Claro

• Es el tipo más común.
• Emplea luz visible que atraviesa la muestra.
• Las muestras se visualizan por la diferencia de contraste (absorción de luz) entre la muestra y su entorno. A menudo requiere tinción para aumentar el contraste de las células bacterianas, que son mayormente transparentes.
• Permite observar células con aumentos totales de hasta 1000-1500x.
• Su límite de resolución es de aproximadamente 0.2 µm (200 nm).

Conceptos Clave en Microscopía

• Aumento Total: Producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular (Aumento Total = Aumento Objetivo x Aumento Ocular).
• Resolución (Poder de Resolución): Capacidad de una lente o sistema óptico para distinguir como entidades separadas dos objetos pequeños que están muy próximos. Se expresa numéricamente por el límite de resolución (d).
• Límite de Resolución (d): Distancia mínima requerida entre dos puntos para que puedan ser visualizados como objetos separados. Cuanto menor es ‘d’, mayor es la resolución.
• Fórmula de Abbe para el Límite de Resolución: d = 0.5 * λ / (n * sen α)
  • λ (lambda): Longitud de onda de la luz utilizada (luz visible ~400-700 nm). Menor λ mejora la resolución.
  • n: Índice de refracción del medio entre la lente del objetivo y la muestra (aire n≈1; aceite de inmersión n≈1.5). Mayor n mejora la resolución.
  • sen α (seno de alfa): Seno del semiángulo de apertura de la lente del objetivo (medida de la cantidad de luz que recoge la lente). Mayor apertura numérica (NA = n * sen α) mejora la resolución.
• Comparación Límites de Resolución: Ojo humano ≈ 0.2 mm (200 µm); Microscopio óptico ≈ 0.2 µm (200 nm); Microscopio electrónico ≈ 0.2 nm.

Observación de Microorganismos

Observación Directa de Muestras Microbianas (Sin Tinción)

• Preparaciones en Fresco: Se observa la muestra viva en una gota de líquido entre portaobjetos y cubreobjetos.
  • Montaje Húmedo Simple: Gota de suspensión en porta, cubierta con cubre. Útil para observar morfología y movilidad. Se seca rápidamente.
  • Montaje Húmedo en Gota Pendiente: Gota de suspensión en el cubreobjetos, que se invierte sobre un portaobjetos excavado sellado con vaselina. Evita la evaporación rápida, mejor para observar movilidad y procesos vitales.
• Requiere microscopios que aumenten el contraste sin tinción (campo oscuro, contraste de fases).

Técnicas de Tinción de los Procariotas

• Objetivo de la tinción: Aumentar el contraste entre las células y el medio para facilitar su visualización con microscopio de campo claro. Además, algunas tinciones proporcionan información morfológica y estructural de valor taxonómico o diagnóstico.
• Colorantes: Compuestos orgánicos que tienen afinidad química por componentes celulares. Poseen grupos cromóforos (que dan color) y grupos auxocromos (que permiten la unión a la célula, a menudo por carga iónica).
  • Generalmente son compuestos ionizables:
    • a) Colorantes catiónicos o básicos: Tienen carga positiva (ej. azul de metileno, cristal violeta, safranina, fucsina básica). Se unen a estructuras celulares con carga negativa (ADN, ARN, proteínas ácidas, superficie celular). Son los más utilizados en bacteriología.
    • b) Colorantes aniónicos o ácidos: Tienen carga negativa (ej. eosina, fucsina ácida, nigrosina). Se unen a estructuras con carga positiva o son repelidos por la superficie celular (carga negativa), tiñendo el fondo (tinción negativa).
• Tipos de Tinciones:
  • a) Tinción Negativa: Se tiñe el fondo (el entorno) pero no las células, que aparecen claras y refringentes sobre fondo oscuro. Usa colorantes ácidos (nigrosina, tinta china). Útil para observar la forma, tamaño y agrupaciones de los microorganismos sin distorsión por calor, y para visualizar cápsulas (que no se tiñen).
  • b) Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante básico (ej. azul de metileno). Tiñe todas las células presentes, permitiendo observar su morfología (forma, tamaño, agrupación).
  • c) Tinción Diferencial: Se usan dos o más colorantes y etapas de decoloración. Permiten diferenciar entre distintos tipos de microorganismos o entre estructuras de una misma célula basándose en sus propiedades químicas o físicas.
    • Ejemplos clave:
      • Tinción de Gram: Diferencia bacterias en Gram positivas (violeta) y Gram negativas (rosa/rojo) basándose en la estructura de su pared celular. Es la tinción más importante en bacteriología.
      • Tinción Ácido-Alcohol Resistente (Ziehl-Neelsen): Diferencia bacterias ácido-alcohol resistentes (rojo/fucsia, ej. Mycobacterium) de las no resistentes (azul) basándose en la composición lipídica de su pared (alto contenido en ácidos micólicos).
  • d) Tinciones Especiales (Estructurales): Diseñadas para poner de manifiesto estructuras celulares específicas que no se ven bien con tinciones simples o diferenciales.
    • Ejemplos: Tinción de endosporas (Schaeffer-Fulton), tinción de flagelos (requiere mordientes para engrosarlos), tinción de cápsulas (combinación de tinción negativa y simple), tinción de gránulos metacromáticos (Volutina), tinción de lípidos (Sudán Negro).

Pasos Generales para la Tinción de Células Bacterianas

1. Preparación de un Frotis: Extender una pequeña cantidad de cultivo (líquido o sólido resuspendido en agua) sobre un portaobjetos limpio, formando una capa fina. Dejar secar al aire.
2. Fijación: Matar las células y adherirlas firmemente al portaobjetos para que no se laven durante la tinción. También preserva la morfología. La más común es la fijación por calor (pasar el portaobjetos rápidamente por la llama 2-3 veces). También existe fijación química (ej. metanol).
3. Tinción: Aplicar los colorantes y reactivos según el protocolo específico de la tinción elegida (implica cubrir el frotis con el colorante, esperar un tiempo, lavar con agua, aplicar decolorantes si procede, aplicar contracolorantes si procede, lavar y secar).
4. Observación Microscópica: Observar el frotis teñido y seco al microscopio, generalmente empezando por objetivos de menor aumento y progresando hasta el de inmersión (100x) con aceite.

T14. Cultivo de los Microorganismos

Requerimientos Nutricionales de los Microorganismos

Nutrientes: Sustancias químicas presentes en el ambiente que los microorganismos utilizan para obtener energía y sintetizar los componentes celulares necesarios para crecer y mantener sus funciones vitales.

Clasificación Nutricional de los Microorganismos

Se clasifican según sus fuentes primarias de energía y carbono:

• a) Según la Fuente de Energía:
  • Fotótrofos: Utilizan la luz como fuente de energía.
  • Quimiótrofos: Obtienen energía de la oxidación de compuestos químicos.
    • Quimioorganótrofos: Oxidan compuestos orgánicos.
    • Quimiolitótrofos: Oxidan compuestos inorgánicos (ej. H₂, NH₃, NO₂⁻, H₂S, S⁰, Fe²⁺).
• b) Según la Fuente de Carbono:
  • Autótrofos: Utilizan CO₂ como fuente principal de carbono celular (lo fijan).
  • Heterótrofos: Utilizan compuestos orgánicos preformados como fuente de carbono.

Principales Tipos Nutricionales y Microorganismos Representativos

• Fotoautótrofos: Luz + CO₂. Ej: Algas, cianobacterias (fotosíntesis oxigénica), bacterias rojas y verdes del azufre (fotosíntesis anoxigénica).
• Fotoheterótrofos: Luz + Compuestos orgánicos. Ej: Bacterias rojas y verdes no del azufre (fotosíntesis anoxigénica).
• Quimiolitoautótrofos: Compuestos inorgánicos + CO₂. Ej: Bacterias oxidantes del azufre, bacterias del hidrógeno, bacterias nitrificantes (Nitrosomonas, Nitrobacter), bacterias oxidantes del hierro, carboxidobacterias (oxidan CO).
• Quimiolitoheterótrofos (Mixótrofos): Compuestos inorgánicos (energía) + Compuestos orgánicos (carbono). Ej: Algunas bacterias oxidantes del azufre (Beggiatoa).
• Quimioorganoheterótrofos: Compuestos orgánicos (energía y carbono). Es el grupo más común, incluye la mayoría de bacterias no fotosintéticas (incluyendo patógenas), hongos y protozoos.

Tipos de Nutrientes

• Macronutrientes: Requeridos en grandes cantidades (g/L o mg/L). Constituyen la mayor parte del peso seco de la célula (≈ 95%).
  • C, H, O, N, S, P: Los más abundantes (requeridos en g/L). Componentes de carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos.
  • K, Ca, Mg, Na, Fe: Requeridos en menor proporción (mg/L). Actúan como cofactores enzimáticos, estabilizadores de estructuras celulares, etc.
• Micronutrientes (Elementos Traza): Requeridos en cantidades muy pequeñas (µg/L). Generalmente actúan como cofactores enzimáticos o componentes de moléculas especiales.
  • Ej: Co (Vitamina B₁₂), Zn, Mo (nitrogenasa), Mn, Ni (hidrogenasa), Cu (citocromo oxidasa).
  • A menudo presentes como contaminantes en el agua o en otros componentes del medio.
• Factores de Crecimiento: Nutrientes orgánicos esenciales que la célula no puede sintetizar y deben ser aportados en el medio. Son requeridos por algunos microorganismos (auxótrofos).
  • Tipos: Aminoácidos (para síntesis de proteínas), Bases púricas y pirimidínicas (para síntesis de ácidos nucleicos), Vitaminas (funcionan como coenzimas o precursores de coenzimas, ej. PABA, ácido fólico, biotina, tiamina, vitamina B₁₂, vitamina K).

Funciones de los Macronutrientes (Ejemplo en E. coli)

• Carbono (C): ≈ 50% del peso seco. Esqueleto de todas las moléculas orgánicas.
• Oxígeno (O): ≈ 17%. Componente del agua celular y moléculas orgánicas. Aceptor final de electrones en respiración aerobia.
• Hidrógeno (H): ≈ 8%. Componente del agua y moléculas orgánicas.
• Nitrógeno (N): ≈ 13%. Componente de aminoácidos (proteínas), bases nitrogenadas (ácidos nucleicos), algunos glúcidos y lípidos.
• Fósforo (P): ≈ 2.5%. Componente de ácidos nucleicos, fosfolípidos, ATP, LPS (Gram neg.), cofactores.
• Azufre (S): ≈ 1.8%. Componente de aminoácidos (cisteína, metionina), algunas vitaminas (tiamina, biotina, ácido lipoico), coenzima A.
• Potasio (K⁺): Requerido para la actividad de algunas enzimas, balance osmótico.
• Magnesio (Mg²⁺): Cofactor de muchas enzimas (ej. quinasas), estabiliza ribosomas, membranas y ácidos nucleicos.
• Calcio (Ca²⁺): Cofactor de algunas enzimas, papel clave en la termorresistencia de endosporas, ayuda a estabilizar paredes celulares.
• Sodio (Na⁺): Requerido por algunos microorganismos (especialmente marinos y halófilos), implicado en transporte.
• Hierro (Fe²⁺/Fe³⁺): Componente de citocromos y proteínas Fe-S (importantes en respiración y fotosíntesis), cofactor de enzimas. Esencial pero a menudo poco soluble; muchos microorganismos producen sideróforos (moléculas quelantes de Fe³⁺) para captarlo del ambiente. Se requiere generalmente en mayor concentración que otros micronutrientes.

Medios de Cultivo

Medio de cultivo: Preparación líquida o sólida que contiene todos los nutrientes (macro y micronutrientes, factores de crecimiento si son necesarios) y condiciones fisicoquímicas adecuadas (pH, presión osmótica) para permitir el crecimiento de los microorganismos in vitro.

Composición General de los Medios

• Fuente de Carbono: Orgánica (azúcares, peptonas) o inorgánica (CO₂).
• Fuente de Nitrógeno: Orgánica (aminoácidos, peptonas) o inorgánica (sales de amonio, nitratos).
• Fuente de Energía: Química (compuestos orgánicos/inorgánicos) o lumínica.
• Sales Minerales: Para aportar S, P, K, Mg, Fe, etc.
• Factores de Crecimiento: Vitaminas, aminoácidos, etc. (si son necesarios).
• Agua: Disolvente universal.
• Otros componentes (según el tipo de medio):
  • Peptonas: Digeridos enzimáticos o químicos de proteínas (animales o vegetales), ricas en péptidos y aminoácidos. Fuente de C, N y energía. Favorecen un buen crecimiento.
  • Extractos: Extracto de carne, extracto de levadura. Contienen aminoácidos, vitaminas, cofactores, sales. Aceleran el crecimiento.
  • Fluidos corporales: Sangre, suero, plasma. Contienen factores de crecimiento especiales para microorganismos exigentes (patógenos).
  • Sistema Amortiguador (Tampón/Buffer): Mantiene el pH estable (ej. tampones fosfato, Tris).
  • Indicadores de pH: Sustancias que cambian de color según el pH, para detectar producción de ácidos o bases (ej. rojo fenol, rojo neutro).
  • Agentes Reductores: Para eliminar el oxígeno disuelto y permitir el crecimiento de anaerobios (ej. tioglicolato, cisteína).
  • Agentes Selectivos: Sustancias que inhiben el crecimiento de algunos microorganismos pero no de otros (ej. antibióticos, sales biliares, cristal violeta, alta concentración de sal).
  • Agente Gelificante (para medios sólidos): Agar-agar. Polisacárido complejo extraído de algas marinas rojas. Se usa al 1.5-2% para solidificar. Funde a ~95°C y solidifica a ~40-45°C. No es nutriente para la mayoría de bacterias.

Tipos de Medios de Cultivo

• Según el Estado Físico:
  • Líquidos (Caldos): Sin agente gelificante. El crecimiento se manifiesta por turbidez, formación de película o sedimento.
  • Sólidos: Contienen agar (1.5-2%). Permiten obtener colonias aisladas. Se preparan en placas de Petri o tubos inclinados (agar inclinado).
  • Semisólidos: Contienen baja concentración de agar (0.3-0.5%). Útiles para estudiar la movilidad bacteriana o para cultivos microaerófilos.
• Según la Composición Química:
  • Sintéticos o Definidos: Todos sus componentes químicos son conocidos y están en concentraciones exactas. Útiles para estudios nutricionales y metabólicos.
  • Complejos o Indefinidos: Contienen ingredientes de composición química no exactamente conocida (ej. peptonas, extractos). Permiten el crecimiento de muchos microorganismos, incluyendo los nutricionalmente exigentes. Son los más usados rutinariamente.
• Según su Uso u Objetivo:
  • a) Medios Generales o Basales: Permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos no exigentes (ej. Caldo Nutritivo, Agar Nutritivo, Agar Tripticasa Soja – TSA, Agar de Recuento en Placa – PCA).
  • b) Medios Enriquecidos: Medios generales a los que se añaden nutrientes especiales (ej. sangre, suero, extracto de levadura) para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes (con requerimientos nutricionales complejos). Ej: Agar Sangre, Agar Chocolate.
  • c) Medios Selectivos: Favorecen el crecimiento de microorganismos específicos e inhiben el crecimiento de otros presentes en la misma muestra. Contienen agentes selectivos. Ej: Agar MacConkey (selectivo para Gram negativas), Agar Manitol Salado (selectivo para Staphylococcus), Agar Sabouraud (selectivo para hongos, por pH ácido y antibióticos).
  • d) Medios Diferenciales: Permiten distinguir entre diferentes grupos de microorganismos que crecen en el mismo medio, basándose en alguna característica bioquímica que se manifiesta visualmente (ej. cambio de color del medio o de las colonias). Contienen indicadores o sustratos específicos. Muchos medios son a la vez selectivos y diferenciales. Ej: Agar MacConkey (diferencia fermentadores de lactosa de no fermentadores), Agar Manitol Salado (diferencia S. aureus de otros estafilococos), Agar Sangre (diferencia tipos de hemólisis).
  • e) Medios de Enriquecimiento (Líquidos): Medios líquidos selectivos que favorecen el crecimiento de un tipo particular de microorganismo presente en bajo número en una muestra mixta, aumentando su proporción relativa antes de aislarlo en medio sólido. Ej: Caldo Selenito (para Salmonella).
  • f) Medios de Transporte: Diseñados para mantener la viabilidad de los microorganismos en una muestra durante el transporte al laboratorio, sin permitir un crecimiento significativo que altere las proporciones originales. Ej: Medio Stuart, Medio Amies.

Ejemplos de Medios Selectivos y Diferenciales

• Agar Violeta Rojo Bilis Lactosa (VRBA):
  • Tipo: Complejo, selectivo y diferencial.
  • Uso: Aislamiento y recuento de bacterias coliformes (bacilos Gram negativos, fermentadores de lactosa, indicadores de contaminación fecal, ej. E. coli) en agua y alimentos.
  • Selectividad: Sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de la mayoría de Gram positivos.
  • Diferenciación: Contiene lactosa como fuente de carbono y rojo neutro como indicador de pH. Las bacterias que fermentan la lactosa producen ácidos, bajando el pH. A pH ácido (<6.8), el rojo neutro vira a rojo/rosado y las sales biliares precipitan.
  • Resultado: Colonias de coliformes son rojo-rosadas y rodeadas de un halo opaco de precipitación biliar. Colonias de no fermentadores son incoloras.
  • Componentes: Peptona, extracto de levadura, lactosa, cloruro sódico, sales biliares, cristal violeta, rojo neutro, agar. pH ≈ 7.4.
• Agar Manitol Salado (MSA):
  • Tipo: Complejo, selectivo y diferencial.
  • Uso: Aislamiento y diferenciación de Staphylococcus, especialmente Staphylococcus aureus (patógeno frecuente).
  • Selectividad: Alta concentración de cloruro sódico (7.5%) inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias excepto los estafilococos (que son halotolerantes).
  • Diferenciación: Contiene manitol como carbohidrato fermentable y rojo fenol como indicador de pH. S. aureus fermenta el manitol produciendo ácidos, lo que hace virar el indicador de rojo (pH neutro/alcalino) a amarillo (pH ácido <6.8). Otras especies de Staphylococcus (ej. S. epidermidis) generalmente no fermentan el manitol.
  • Resultado: Colonias de S. aureus son amarillas y rodeadas de un halo amarillo. Colonias de otros estafilococos son rosadas/rojas y el medio circundante permanece rojo.
  • Componentes: Extracto de carne, peptona, cloruro sódico (7.5%), D-Manitol, rojo fenol, agar. pH ≈ 7.4.
• Agar Sangre:
  • Tipo: Complejo, enriquecido y diferencial.
  • Uso: Cultivo de microorganismos exigentes y detección de actividad hemolítica (producción de hemolisinas que lisan glóbulos rojos).
  • Enriquecimiento: Se añade sangre estéril (generalmente de oveja o caballo, al 5-10%) a una base de agar nutritivo (ej. TSA) fundido y enfriado a 45-50°C.
  • Diferenciación (Tipos de Hemólisis):
    • α-hemólisis (alfa): Lisis parcial de los glóbulos rojos. Se observa un halo verdoso y translúcido alrededor de la colonia (debido a la reducción de hemoglobina a metahemoglobina). Ej: Streptococcus pneumoniae, algunos estreptococos viridans.
    • β-hemólisis (beta): Lisis completa de los glóbulos rojos. Se observa un halo claro y transparente alrededor de la colonia. Ej: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus.
    • γ-hemólisis (gamma) o no hemolítico: No hay lisis de los glóbulos rojos. No se observa cambio en el medio alrededor de la colonia. Ej: Enterococcus faecalis, Staphylococcus epidermidis.

Esterilización del Material y Medios de Cultivo

Esterilización: Proceso que destruye o elimina todas las formas de vida microbiana, incluyendo células vegetativas, esporas y virus.

Métodos comunes en microbiología:

• Calor Húmedo: Autoclave. Es el método más eficaz y utilizado para esterilizar medios de cultivo, soluciones acuosas, material de vidrio, material quirúrgico, residuos contaminados. Utiliza vapor de agua a presión (típicamente 121°C a 1 atm de sobrepresión o 15 psi) durante 15-20 minutos. El calor húmedo penetra mejor y mata más eficientemente que el calor seco.
• Calor Seco: Horno Pasteur (Estufa de Esterilización). Se utiliza para material de vidrio (placas de Petri, matraces, pipetas), instrumentos metálicos, polvos, aceites. Requiere temperaturas más altas y tiempos más largos que el autoclave (ej. 160-170°C durante 2-3 horas).
• Filtración: Método para esterilizar líquidos o gases sensibles al calor (termolábiles), como soluciones de vitaminas, antibióticos, azúcares, medios de cultivo con componentes lábiles, aire para cabinas de flujo laminar. Utiliza filtros con tamaño de poro suficientemente pequeño (ej. 0.22 µm) para retener los microorganismos. No elimina virus pequeños ni priones.
• Radiación: Radiación ionizante (rayos gamma, rayos X) para material médico de plástico de un solo uso. Radiación no ionizante (luz ultravioleta – UV) para esterilizar superficies y aire en cabinas.
• Gases Esterilizantes: Óxido de etileno, formaldehído. Para material sensible al calor y la humedad. Son tóxicos y requieren precaución.

Cultivo de los Microorganismos

Condiciones Ambientales de Cultivo

Además de los nutrientes, se deben controlar factores ambientales:

• Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura óptima, mínima y máxima de crecimiento. Se usan estufas de incubación o incubadores con agitación (para cultivos líquidos).
• pH: La mayoría de bacterias crecen a pH neutro (6.5-7.5), hongos prefieren pH ácido (5-6). Se ajusta con tampones.
• Atmósfera Gaseosa (Oxígeno):
  • Aerobios estrictos: Requieren O₂.
  • Anaerobios facultativos: Crecen con o sin O₂, pero mejor con O₂.
  • Anaerobios estrictos: El O₂ es tóxico. Requieren condiciones anaeróbicas (ej. jarras de anaerobios con generadores de gas o catalizadores, cámaras de anaerobiosis).
  • Anaerobios aerotolerantes: No usan O₂ pero lo toleran.
  • Microaerófilos: Requieren O₂ a concentraciones bajas (2-10%).
• Presión Osmótica: La mayoría prefiere medios isotónicos. Halófilos requieren alta concentración de sal.

Aislamiento de Microorganismos (Obtención de Cultivos Puros)

Un cultivo puro contiene una sola especie o cepa microbiana. Es esencial para estudiar las características de un microorganismo. Se obtiene a partir de una muestra mixta mediante técnicas de aislamiento en medio sólido.

Métodos de Siembra para Aislamiento:

• Siembra por Estría en Placa (Streak Plate): Técnica más común. Se estría el inóculo sobre la superficie de una placa de agar con un asa de siembra, diluyendo progresivamente las células en cada sector de la estría. El objetivo es obtener colonias aisladas en el último sector, cada una originada teóricamente por una sola célula (UFC).
• Siembra en Masa (Pour Plate): Se añade un volumen conocido del inóculo (diluido) a una placa de Petri vacía, y luego se vierte el medio de cultivo fundido y atemperado (~45-50°C). Se mezcla y se deja solidificar. Las colonias crecen dentro y sobre el agar. Útil para recuento y aislamiento de anaerobios facultativos o microaerófilos.
• Siembra en Superficie (Spread Plate): Se deposita un pequeño volumen (0.1 mL) del inóculo (diluido) sobre la superficie de una placa de agar ya solidificada y se extiende uniformemente con un asa de vidrio acodada estéril (rastrillo de Drigalsky). Las colonias crecen solo en la superficie. Útil para recuento y aislamiento.

Morfología de las Colonias

Una colonia es una masa visible de microorganismos que crece sobre un medio sólido, originada a partir de una sola célula o UFC. Las características de las colonias (tamaño, forma, elevación, margen, superficie, consistencia, color, opacidad) son a menudo típicas de cada especie y ayudan en la identificación.

• Forma: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide.
• Elevación: Plana, elevada, convexa, umbonada (con centro elevado).
• Margen (Borde): Liso (entero), ondulado, lobulado, filamentoso, rizoide.

Mantenimiento y Conservación de Cultivos Puros

• Mantenimiento a Corto Plazo: Resiembras periódicas (subcultivos) en medios de mantenimiento adecuados (ej. agar inclinado) y conservación a 4°C (refrigeración).
• Conservación a Largo Plazo: Para preservar la viabilidad y características genéticas durante meses o años.
  • Congelación: A -70°C o en nitrógeno líquido (-196°C), generalmente en presencia de agentes crioprotectores (ej. glicerol 10-25%, DMSO) para evitar la formación de cristales de hielo dañinos.
  • Liofilización (Desecación en Vacío desde Congelación): Se congela el cultivo y luego se sublima el agua al vacío. Se obtiene un polvo seco que se sella y almacena a 4°C o temperatura ambiente. Es el mejor método para conservación a muy largo plazo.

Colecciones de Cultivo

Instituciones que mantienen y distribuyen cepas microbianas de referencia autenticadas y caracterizadas. Ejemplos:

• CECT: Colección Española de Cultivos Tipo (Valencia, España).
• ATCC: American Type Culture Collection (Manassas, Virginia, USA).

PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Esterilización

• Esterilización por Calor Seco (Horno Pasteur): Se utiliza para esterilizar material de vidrio limpio y seco (ej. placas Petri, matraces, probetas, tubos, pipetas). La esterilización se consigue manteniendo el material a temperaturas de 160-180°C durante 2-3 horas.
• Esterilización por Calor Directo (Incineración/Flameado): Se emplea para esterilizar rápidamente el asa de siembra metálica (calentándola al rojo vivo en la llama del mechero Bunsen). El asa de vidrio (rastrillo de Drigalsky) se esteriliza sumergiéndola en alcohol y flambeándola brevemente en la llama (¡con precaución!).
• Esterilización por Calor Húmedo (Autoclave): Se utiliza para esterilizar los medios de cultivo, soluciones acuosas, material de vidrio resistente, puntas de pipeta, etc. Se somete el material a 121°C (vapor saturado a 1 atm de sobrepresión) durante 15-20 minutos. Los medios de cultivo sólidos que contienen agar deben ser vertidos en placas Petri estériles o colocados en tubos mientras aún están líquidos (atemperados a 50-60°C) para evitar su solidificación prematura.

Resiembra de Microorganismos (Subcultivo)

Transferencia de microorganismos de un cultivo a un medio fresco para mantenerlos viables o propagarlos. Ejemplo: Resembrar Micrococcus luteus y Pseudomonas aeruginosa en placas de agar nutritivo. Incubar en estufa a 37°C durante 24 horas.

Aislamiento de Microorganismos

Siembra por Agotamiento (Estría en Placa): Técnica utilizada para obtener colonias aisladas a partir de una muestra mixta o un cultivo. Cada colonia aislada proviene teóricamente del crecimiento de una sola célula (UFC) y representa un cultivo puro.

Uso de Medios Selectivos y Diferenciales en Aislamiento

• Agar VRBA (Violeta Rojo Bilis Lactosa):
  • Objetivo: Aislamiento, recuento e identificación presuntiva de bacterias coliformes (ej. E. coli) como indicadores de contaminación fecal.
  • Características de Coliformes: Bacilos cortos (cocobacilos), Gram negativos, anaerobios facultativos, fermentan la lactosa produciendo ácidos (succínico, láctico, acético, fórmico).
  • Funcionamiento del Medio:
    • Selectivo: Sales biliares y cristal violeta inhiben Gram positivos.
    • Diferencial: Lactosa + Rojo neutro. Fermentación -> Ácido -> pH bajo -> Rojo neutro vira a rojo/púrpura + Precipitación de sales biliares.
  • Resultado Esperado: Colonias de coliformes de color rojo púrpura rodeadas de halo opaco-rosado.
• Agar Manitol Salado (MSA):
  • Objetivo: Aislamiento, recuento e identificación presuntiva de Staphylococcus aureus.
  • Características de S. aureus: Coco, Gram positivo, agrupado en racimos, aerobio/anaerobio facultativo, halotolerante, fermenta el manitol.
  • Funcionamiento del Medio:
    • Selectivo: Alta [NaCl] (7.5%) inhibe la mayoría de bacterias no estafilocócicas.
    • Diferencial: Manitol + Rojo fenol. Fermentación de manitol por S. aureus -> Ácido -> pH bajo -> Rojo fenol vira de rojo a amarillo.
  • Resultado Esperado: Colonias de S. aureus amarillas rodeadas de halo amarillo. Otras especies como Staphylococcus epidermidis (no fermentador de manitol) crecen pero forman colonias rosadas/rojas sin cambio de color del medio.